NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及機制研究.pdf

1、目的：建立新的小鼠骨癌痛模型，觀察NMDA受體2B亞基(NR2B)在骨癌痛小鼠前腦扣帶回和脊髓中的表達及分布情況；明確NR2B與癌痛產(chǎn)生之間的關系；探討NR2B在小鼠骨癌痛中的作用機制。
　　 方法：
　　 1.小鼠骨癌痛新模型的制備及評價：選用成年雄性C57BL/6小鼠30只，隨機分為4組，模型組(15只)：接種Lewis肺癌細胞2×106個；熱滅活組(5只)：接種相同數(shù)目加熱滅活的Lewis肺癌細胞；PBS組(5只)

2、：接種等容積的PBS液；正常對照組(5只)：不予任何處理。接種后7天始隔日觀察小鼠自發(fā)痛行為及測定機械性觸誘發(fā)痛。第7、15、23天，將小鼠麻醉后行雙側后肢X線攝片，評估腫瘤誘發(fā)的骨組織破壞程度。模型組小鼠每次攝片后任選5只取術側后肢，各對照組小鼠最后一次攝片后取術側后肢，分別作蘇木素-伊紅(HE)染色觀察骨質(zhì)破壞情況。
　　 2.NR2B在骨癌痛小鼠前扣帶回和脊髓中的分布與表達：選用成年雄性C57BL/6小鼠81只，隨機分為3

3、組：癌痛組，假手術組和正常對照組。觀察三組小鼠自發(fā)痛行為及測定機械性觸誘發(fā)痛。分別于術后第6、10、14、18、22天各取3只，實時定量PCR檢測前扣帶回和脊髓NR2B mRNA的表達。依據(jù)PCR結果，每組分別于術后第14、18天各取3只，免疫組化檢測前扣帶回和脊髓NR2B的分布和表達；同時每組另各取3只，于術后第14、18天行Western Blot檢測脊髓NR2B蛋白的表達。
　　 3.脊髓NR2B基因沉默對小鼠骨癌痛的影響

4、：選用成年雄性C57BL/6小鼠72只，隨機分為3組：癌痛組，干擾組和干擾對照組。觀察各組小鼠自發(fā)痛行為及測定機械性觸誘發(fā)痛。每組分別于接種后第13、14、15、16、18、22天各取3只，實時定量PCR檢測脊髓NR2B mRNA的表達。依據(jù)PCR的結果，于接種后第14和18天每組各取3只，Western Blot檢測脊髓NR2B蛋白的表達。
　　 4.MAPK信號通路介導的NR2B在小鼠骨癌痛中的作用機制：選用成年雄性C57B

5、L/6小鼠48只，隨機分為4組：正常組，癌痛組，干擾組和干擾對照組。觀察各組小鼠自發(fā)痛行為及測定機械性觸誘發(fā)痛。每組分別于接種后第14和18天各取3只，實時定量PCR檢測脊髓NR2B、SP、c-fos和GFAP基因表達水平。選取接種后第14和18天的每組小鼠各3只，Western Blot檢測脊髓NR2B、p-ERK、p-p38和GFAP蛋白表達水平。
　　 結果：
　　 1.小鼠骨癌痛新模型的評價：模型組接種后第11天

6、左右出現(xiàn)明顯自發(fā)痛行為，表現(xiàn)為自發(fā)抬足時間延長；接種后第13天左右出現(xiàn)明顯的觸誘發(fā)痛，表現(xiàn)為50％縮足閾值明顯下降，且持續(xù)整個觀察期。接種后第23天放射學結果顯示，術側股骨下段骨髓腔消失，骨皮質(zhì)中斷、大塊缺損。同時組織學可見腫瘤細胞充滿骨髓腔，且穿破骨皮質(zhì)向外生長，侵犯周圍肌肉組織。行為學、放射學、組織學三方面證實建模成功。
　　 2.NR2B在骨癌痛小鼠的前扣帶回和脊髓中的分布與表達：
　　 (1)前扣帶回NR2B的實

7、時熒光定量PCR結果顯示：接種后第6天、10天，癌痛組NR2B的表達與假手術組比較無顯著差異，而癌痛組和假手術組NR2B的表達比正常組明顯增高：第14天、18天，癌痛組NR2B的表達明顯增加，與假手術組和正常組比較，有顯著差異(p<0.05)，而假手術組與正常組比較，無顯著差異(p>0.05)；第22天，癌痛組NR2B的表達下降，與假手術組和正常組比較無統(tǒng)計學意義。LA-6段脊髓NR2B的實時熒光定量PCR示：接種后第6天，癌痛組NR2

8、B的表達與假手術組比較無顯著差異，而癌痛組和假手術組NR2B的表達比正常組明顯增高；第10、14、18、22天，癌痛組NR2B的表達明顯增加，與假手術組和正常組比較，有顯著差異(p<0.05)；而假手術組與正常組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 (2)L4-6段脊髓和前扣帶回NR2B免疫組化測定結果：癌痛組NR2B主要分布在脊髓背角淺層、中央導水管、前角以及小鼠的前扣帶回，脊髓各層NR2B表達量在中央導水管、背角淺層、前

9、角依次增多。癌痛組于術后第14、18天，脊髓和手術對側的前扣帶回區(qū)NR2B陽性細胞光密度(OD)值與假手術組和正常組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；而假手術組與正常組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 (3)L4-6段脊髓NR2B表達的Western Blot檢測結果：癌痛組于接種后第14天、18天，脊髓NR2B的表達明顯增高，與假手術組和正常組比較，有顯著差異(p<0.05)；而假手術組與正常組比較，無顯著差異(p>0

10、.05)。
　　 3.脊髓NR2B基因沉默對小鼠骨癌痛的影響：
　　 (1)實時定量PCR檢測小鼠脊髓NR2B mRNA的表達：接種后第14天和第18天干擾組小鼠L4-6段脊髓的NR2B mRNA表達水平比癌痛組明顯降低，其中第14天下調(diào)最明顯，干擾組比癌痛組NR2B的表達下調(diào)了74％；而干擾對照組與癌痛組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 (2)Western Blot檢測小鼠脊髓NR2B蛋白的表達：接種

11、后第14和18天干擾組小鼠LA-6段脊髓的NR2B表達水平比癌痛組明顯降低，其中第18天下調(diào)最明顯，干擾組比癌痛組NR2B表達下調(diào)了67％；而干擾對照組與癌痛組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 (3)干擾組與其他兩組相比，自發(fā)抬足時間明顯縮短，觸誘發(fā)痛閾值明顯增加，有顯著差異(p<0.05)。
　　 4.MAPK信號通路介導的NR2B在小鼠骨癌痛中的作用機制：
　　 (1)實時定量PCR檢測各組小鼠LA-

12、6段脊髓的NR2B、SP、c-fos和GFAP基因mRNA的表達：接種術后第14、18天癌痛組小鼠脊髓的NR2B、SP、c-fos和GFAP基因表達比正常組明顯上調(diào)(p<0.05)；干擾組NR2B、SP、c-fos和GFAP基因表達比癌痛組顯著降低(p<0.05)；而干擾對照組與癌痛組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 (2)Western Blot檢測各組小鼠L4-6段脊髓的NR2B、p-ERK、p—p38和GFAP蛋白

13、的表達：接種后第14、18天癌痛組小鼠脊髓的NR2B、p-ERK、p-p38和GFAP的蛋白表達比正常組明顯上調(diào)(p<0.05)；干擾組NR2B、p-ERK、p-p38和GFAP的蛋白表達比癌痛組顯著降低(p<0.05)；而干擾對照組與癌痛組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 結論：
　　 1.C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接種Lewis肺癌細胞能成功制備小鼠骨癌痛新模型，此模型與人類骨癌痛具有相似性;
　　

14、 2.NR2B在小鼠骨癌痛模型中呈高表達，且同一癌痛模型中觀察到NR2B在L4-L6段脊髓和前扣帶回同時高表達，提示在癌痛的產(chǎn)生和維持中不僅激活了脊髓低位中樞，而且有腦部中樞參與；
　　 3.本研究初次發(fā)現(xiàn)NR2B在癌痛模型的L4-6段脊髓前角細胞表達呈強陽性，為下一步研究提供了新的思路；
　　 4.PEI/NR2B-siRNA復合物能特異性的使骨癌痛小鼠脊髓NR2B的表達明顯下調(diào)；其表達下調(diào)與小鼠疼痛行為學減輕相一致，