前扣帶皮層吻側(cè)部神經(jīng)元NR2B亞基參與骨癌痛形成的分子機(jī)制.pdf

1、脊髓背角是疼痛形成的初級(jí)中樞，眾多研究已表明，脊髓背角的中樞敏化在骨癌痛的產(chǎn)生和形成過程中起著重要作用。外周傷害性信息首先傳遞到脊髓背角，在此匯聚和整合后再向上傳遞，最后形成痛覺。但是，有研究表明，脊髓背角對(duì)傷害性信息的傳遞受到脊髓上中樞如延髓、前扣帶皮層(ACC)等調(diào)控。這種調(diào)控又分為下行性抑制和易化兩種，這在疼痛的形成中同樣起著重要作用。研究脊髓上中樞如何調(diào)控脊髓活動(dòng)成為近來疼痛研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　前扣帶皮層是邊緣系統(tǒng)的重要

2、結(jié)構(gòu)，可接受來自丘腦的纖維傳入，例如前內(nèi)側(cè)丘腦核、中央下核等。這些丘腦核團(tuán)大都接受來自脊髓的傷害性信息傳入。因此脊髓的傷害性信息通過丘腦可傳入ACC。在ACC放置記錄電極，截?cái)嘞轮梢餉CC產(chǎn)生興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)。ACC不但接受外界的信息傳入，還輸出信號(hào)影響調(diào)節(jié)其它核團(tuán)的功能。例如將實(shí)施刺激的對(duì)側(cè)足截?cái)?，結(jié)果正常足上刺激引起的反應(yīng)加強(qiáng)。這提示前扣帶皮層吻側(cè)部

3、(rACC)神經(jīng)元的可塑性改變?cè)谔弁粗衅鹬匾饔?。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)神經(jīng)元的可塑性變化，在前腦主要以NMDA2B受體(NR2B)形式存在。這些研究提示，rACC神經(jīng)元的NR2B可能在骨癌痛的形成中起到重要作用。本課題采用疼痛行為學(xué)、免疫組織化學(xué)及分子生物學(xué)等方法探討rACC神經(jīng)元NR2B亞基參與骨癌痛形成的分子機(jī)制并為臨床骨癌痛治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分 骨癌痛大鼠前扣帶皮層吻側(cè)部神經(jīng)元NR2B亞基

4、表達(dá)的變化
　　目的：
　　觀察骨癌痛大鼠rACC腦區(qū)NR2B亞基的表達(dá)水平。
　　方法：
　　成年Sprague Dawley(SD)大鼠，雌雄不拘，體重200-250g，采取隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為空白對(duì)照組（Naive組），假手術(shù)組（Sham組）及骨癌痛組（Tumor-bearing組）。Tumor-bearing組脛骨上段骨髓腔接種MADB-106大鼠乳腺癌細(xì)胞懸液10μl（細(xì)胞密度約5×106/ml），而Sh

5、am組注射同等劑量的生理鹽水。術(shù)前及術(shù)后21天內(nèi)每隔3天，測(cè)定大鼠機(jī)械痛閾值和熱痛潛伏期以觀察大鼠痛行為的改變。根據(jù)痛行為學(xué)的改變，選取痛行為改變最明顯的4只大鼠，采用免疫組化技術(shù)和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)rACC神經(jīng)元NR2B亞基的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　機(jī)械痛閾值及熱痛潛伏期三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而從術(shù)后第3天開始Tumor-bearing組機(jī)械縮爪閾值及熱痛潛伏期明顯降低，與Naive組和Sham組比較降

6、低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后14天下降最顯著，至術(shù)后21天仍顯著低于對(duì)照組。這提示大鼠出現(xiàn)明顯痛覺過敏，模型復(fù)制成功。免疫熒光顯示，術(shù)后14天大鼠rACC神經(jīng)元NR2B陽性的數(shù)目，Tumor-bearing組顯著高于Naive組和sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。采取術(shù)后14天的大鼠rACC腦組織以Western blot分析顯示，Tumor-bearing組大鼠術(shù)后14天rACC神經(jīng)元NR2B表達(dá)水平較術(shù)前明

7、顯升高，與對(duì)照組比較也顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　脛骨髓腔內(nèi)注射MADB-106大鼠乳腺癌細(xì)胞14天成功復(fù)制大鼠骨癌痛模型，同時(shí)伴隨NR2B亞基的高表達(dá)。
　　第二部分 rACC內(nèi)注射NR2B拮抗劑Ifenprodil對(duì)骨癌痛大鼠機(jī)械痛域和熱痛潛伏期的影響
　　目的：
　　第一部分研究結(jié)果表明，骨癌痛引起rACC神經(jīng)元NR2B亞基的表達(dá)升高，rACC內(nèi)給予NR2B拮抗劑是否

8、減輕骨癌痛？因此，本部分觀察rACC內(nèi)注射Ifenprodil對(duì)骨癌痛機(jī)械痛域和熱痛潛伏期的影響。
　　方法:
　　根據(jù)Paxinos and watson腦定位圖譜定位rACC的位置（前囟前1.7mm，旁開0.6mm，深2.5mm），埋管。術(shù)后觀察7天，無異常大鼠采用脛骨髓腔注射MADB-106大鼠乳腺癌細(xì)胞復(fù)制骨癌痛模型。骨癌痛大鼠大隨機(jī)分為五組: Naive組，BCP組，BCP+NS組，BCP+Ifenprodil組，

9、BCP+CNQX組。BCP+Ifenprodil組左右兩側(cè)rACC給予Ifenprodil0.6μl(0.2g/L)，而對(duì)照組給予同等劑量的生理鹽水或CNQX。測(cè)定給藥前后骨癌痛大鼠的機(jī)械痛閾值，和熱痛潛伏期。痛行為學(xué)測(cè)試完畢后，采用免疫組化法檢測(cè)脊髓背角C-fos神經(jīng)元的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　給藥前Naive組，BCP組，BCP+NS組，BCP+Ifenprodil組，BCP+CNQX，五組機(jī)械痛閾值和熱痛潛伏期差異無統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。注射Ifenprodil后脛骨癌痛大鼠的機(jī)械痛閾值和熱痛潛伏期，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免疫組化顯示，脊髓背角C-fos的表達(dá)BCP+Ifenprodil組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　骨癌痛大鼠rACC腦區(qū)給予NR2B拮抗劑Ifenprodil減輕大鼠的痛敏，并減少脊髓背角C-fos神經(jīng)元的表達(dá)。
　　第三部分 重組慢病毒載體shRN

11、A/NR2B(LV-GluN2B)的構(gòu)建及抑制NR2B效率的檢測(cè)
　　目的:
　　盡管rACC內(nèi)給予Ifenprodil可減輕骨癌痛，但是Ifenprodil鎮(zhèn)痛作用不但時(shí)間短暫而且具有副作用，因此尋找一種鎮(zhèn)痛時(shí)間長且安全有效的鎮(zhèn)痛措施是目前臨床所急需的。小RNA技術(shù)選擇性沉默目的基因的表達(dá)已成為一種成熟的方法，選擇性沉默rACC神經(jīng)元NR2B亞基的表達(dá)可實(shí)現(xiàn)長期鎮(zhèn)痛。因此，本研究擬構(gòu)造siRNA/NR2B重組慢病毒載體以期

12、實(shí)現(xiàn)此目的。
　　方法:
　　根據(jù)基因庫中大鼠NR2B亞基的mRNA序列及shRNA序列的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)3條19nt的靶序列，進(jìn)一步合成含有互補(bǔ)鏈的DNA。將此DNA插入到pFU-GW-iRNA載體質(zhì)粒H1啟動(dòng)子的下游，進(jìn)而獲得3個(gè)含有shRNA/NR2B的重組質(zhì)粒pFU-GW-iRNA/NR2B。同時(shí)構(gòu)建一個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒。將合成的3個(gè)重組質(zhì)粒和NR2B表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以Western blot檢測(cè)目的蛋白NR2

13、B的表達(dá)，進(jìn)而確定沉默效率最高的重組質(zhì)粒。再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，即包裝含有shRNA/NR2B重組慢病毒即LV-GluN2B。
　　結(jié)果:
　　聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有341bp大小的條帶即NR2B-RNAi。結(jié)合測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。Western blot結(jié)果表明，Plv-NR2B3對(duì)目的基因NR2B敲減效率最高。通過轉(zhuǎn)染

14、293T細(xì)胞，最終合成可有效沉默目的基因NR2B的重組慢病毒LV-GluN2B。
　　結(jié)論:
　　重組NR2B-RNAi慢病毒LV-GluN2B構(gòu)建成功。
　　第四部分 選擇性下調(diào)rACC神經(jīng)元NR2B基因的表達(dá)對(duì)骨癌痛大鼠痛覺的影響
　　目的:
　　首先建立大鼠骨癌痛模型，采用腦立體定位技術(shù)rACC內(nèi)注射shRNA/NR2B重組慢病毒，通過下調(diào)rACC神經(jīng)元NR2B亞基的表達(dá)水平觀察下調(diào)NR2B對(duì)大鼠骨癌

15、痛的治療作用。
　　方法:
　　脛骨癌痛大鼠rACC埋管后按照數(shù)字表隨機(jī)分為三組:即生理鹽水組、LV-NC組及LV-GluN2B組，每組8只。采用疼痛測(cè)定儀分別測(cè)量給藥前，及給藥后每隔3天大鼠的機(jī)械痛閾值，以及熱痛潛伏期。在痛行為學(xué)效果最顯著時(shí)間點(diǎn)取大鼠rACC腦組織，采用免疫組化，PCR及Western blot方法檢測(cè)LV-GluN2B對(duì)NR2B基因的敲減效率。
　　結(jié)果:
　　給藥前三組之間的機(jī)械痛閾值和熱

16、痛潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)意義(P＞0.05)，而rACC內(nèi)給予LV-GluN2B后骨癌痛大鼠的機(jī)械痛閾值和熱痛潛伏期均顯著升高，與生理鹽水組和LV-NC組比較，顯著升高，(P＜0.05)。而生理鹽水組和LV-NC組與給藥前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。WB和PCR結(jié)果表明，LV-GluN2B組rACC神經(jīng)元NR2B蛋白和NR2BmRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　rACC內(nèi)給予重組慢病毒LV-G

17、luN2B通過下調(diào)NR2B的表達(dá)減輕骨癌痛。
　　研究意義：
　　本研究首先采用痛行為學(xué)和分子生物學(xué)方法，觀察到骨癌痛可導(dǎo)致rACC神經(jīng)元NR2B表達(dá)水平的上調(diào)，進(jìn)一步通過注射NR2B阻斷劑Ifenprodil發(fā)現(xiàn)可減輕骨癌痛，提示rACC神經(jīng)元NR2B在骨癌痛的產(chǎn)生和形成中起到重要作用。在此基礎(chǔ)上，為了實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛的長期性、有效性及安全性，構(gòu)建了NR2B-RNAi重組慢病毒(LV-GluN2B)，實(shí)現(xiàn)了高選擇性下調(diào)rACC神經(jīng)