大鼠前扣帶皮層SIP30參與痛厭惡情緒反應(yīng)的細胞分子機制.pdf

1、根據(jù)國際疼痛研究協(xié)會對于疼痛的定義，疼痛是一種與組織損傷或潛在的組織損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺和情感體驗，這一定義明確指出了疼痛的兩個基本成分:感覺分辨和情緒體驗。在臨床上，疾病或創(chuàng)傷引起的外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷所致的神經(jīng)病理性疼痛是最為常見的一類慢性痛。越來越多的臨床觀察表明，這些慢性痛患者除了忍受持續(xù)的、劇烈的疼痛外，在精神上也飽受折磨，出現(xiàn)的多種惡性情緒反應(yīng)如恐懼、焦慮、孤獨、厭世等嚴重地影響了患者的生活質(zhì)量。考慮到目前對神經(jīng)病理

2、性痛以及痛相關(guān)厭惡情緒仍缺乏有效的治療手段，尋找和發(fā)現(xiàn)治療的新靶點變得更為迫切。
　　我們與合作實驗室應(yīng)用eDNA array、Northern blot、In situ等技術(shù)，對神經(jīng)病理性疼痛的相關(guān)基因進行了篩選，基因差異表達的結(jié)果表明，sip30是與神經(jīng)病理痛高度相關(guān)的基因之一。SIP30(SNAP25 interacting protein of30 kD)是于2002年首次在耳蝸毛細胞中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，它由266個氨基酸組

3、成，由于可與SNAP25相互作用而得名。研究發(fā)現(xiàn)，SIP30廣泛表達在神經(jīng)系統(tǒng)，以腦內(nèi)表達最為豐富。迄今為止，對SIP30的功能知之甚少。我們前期的研究結(jié)果表明，脊髓中的SIP30作為ERK-CREB信號通路的下游靶點，在神經(jīng)損傷引起的痛覺敏化的發(fā)展和維持過程中起著重要的作用。
　　作為疼痛的重要組成部分，痛情緒和相關(guān)記憶的形成近年來受到了越來越多的關(guān)注。大量的研究結(jié)果表明，前扣帶皮層(Anterior cingulate cor

4、tex，ACC)的激活與痛相關(guān)情緒反應(yīng)以及對疼痛的認知、記憶和預期等過程密切相關(guān)。我們實驗室前期的研究結(jié)果表明，ACC中NMDA受體依賴的cAMP/PKA-ERK-CREB信號通路的激活對于痛相關(guān)厭惡情緒的形成和表達是必需的。那么，高表達在ACC中的SIP30是否參與痛相關(guān)厭惡情緒形成？如果參與，是否是作為cAMP/PKA-ERK-CREB信號通路的下游的靶基因而發(fā)揮作用？SIP30又是如何參與痛相關(guān)厭惡情緒的形成？本研究圍繞這一系列問

5、題，采用行為訓練、分子生物學、免疫組織化學以及離體腦片全細胞膜片鉗記錄等實驗方法，首次系統(tǒng)的研究了ACC中SIP30在痛相關(guān)厭惡情緒中的作用及其可能的細胞分子機制。
　　應(yīng)用免疫組織化學、Western Blot和行為訓練等方法，我們觀察了ACC中SIP30的表達與痛相關(guān)厭惡情緒之間的關(guān)系。結(jié)果表明，外周神經(jīng)損傷（單側(cè)坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷，CCI）能夠引起大鼠雙側(cè)rACC（前扣帶皮層吻側(cè)部）中SIP30蛋白表達水平升高。上調(diào)的SI

6、P30主要表達在ACC第Ⅱ-Ⅲ層錐體神經(jīng)元中，在星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞均未見SIP30表達。雙側(cè)ACC內(nèi)預先微量注射以慢病毒為載體的針對SIP30的shRNA能夠明顯抑制慢性痛引起的明暗回避行為的形成，而不影響CCI引起的觸誘發(fā)痛和熱痛覺過敏以及非痛刺激引起的條件位置回避的形成，提示ACC中的SIP30特異性地參與了痛相關(guān)厭惡情緒的形成。
　　為了研究SIP30蛋白表達上調(diào)的上游調(diào)節(jié)通路，我們觀察了PKA-ERK-CREB信號通

7、路與SIP30之間的關(guān)系。免疫組織化學的結(jié)果顯示，外周神經(jīng)損傷引起雙側(cè)ACC中pPKA、pERK和pCREB表達上調(diào)，且SIP30與pERK和pCREB、pPKA與pERK和pCREB均有很好的共定位。雙側(cè)ACC內(nèi)預先微量注射pPKA抑制劑Rp-cAMP或MEK（ERK激酶）抑制劑PD98059均能在抑制SIP30蛋白表達的同時，抑制慢性痛引起的明暗回避行為，而不影響CCI引起的觸誘發(fā)痛和熱痛覺過敏的形成以及痛覺敏化的程度。這一部分結(jié)果

8、提示，PKA-ERK-CREB信號通路依賴的SIP30蛋白表達水平的升高是痛相關(guān)厭惡情緒形成所必需的。
　　前人免疫共沉淀和酵母雙雜交的結(jié)果表明，SIP30與SNAP25存在直接的相互作用，SNAP25作為SNARE復合物的重要組成部分在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中發(fā)揮作用。為進一步揭示SIP30介導痛厭惡情緒形成的可能機制，我們利用離體腦片全細胞膜片鉗記錄和在體微透析結(jié)合高效液相色譜(HPLC)的方法觀察了SIP30對興奮性突觸傳遞的影響

9、。電生理記錄顯示，電刺激誘發(fā)的ACC神經(jīng)元的興奮性突觸后電流(EPSC)結(jié)果顯示，在SIP30 shRNA組明顯降于陰性對照(negative control，NC)組，提示ACC中SIP30沉默抑制了興奮性突觸傳遞。自發(fā)的興奮性突觸后電流(sEPSC)無論是頻率還是幅度在SIP30 shRNA組都顯著降低，配對脈沖比(PPR)進一步證實SIP30 shRNA組在不同時間間隔的PPR均較NC組明顯升高，提示SIP30沉默不僅抑制了興奮性

10、突觸傳遞，也抑制了突觸前興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。在體微透析結(jié)合HPLC的結(jié)果顯示，雙側(cè)ACC給予SIP30 shRNA后，細胞外的谷氨酸濃度顯著降低，提示SIP30基因沉默抑制了谷氨酸的釋放。
　　在大鼠ACC腦片上，Theta波刺激(theta burst stimulation，TBS)能夠穩(wěn)定誘導出長時程增強(long-term potentiation，LTP)。SIP30基因沉默完全阻斷LTP的產(chǎn)生，提示SIP30對ACC