MHCⅡ參與骨癌痛形成的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　據(jù)國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2015年我國(guó)預(yù)計(jì)新增的惡性腫瘤病例達(dá)429.2萬(wàn)例，其中肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等高轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤發(fā)病比例較高。有報(bào)道指出75～90％進(jìn)展期及終末期的癌癥病人必須接受慢性疼痛治療，其中骨癌痛是治療的重要部分。骨癌痛常發(fā)生于原發(fā)性的骨骼惡性腫瘤或繼發(fā)于前列腺癌、肺癌、乳腺癌等最常波及骨骼的高轉(zhuǎn)移性腫瘤。當(dāng)累及骨骼時(shí)，起初表現(xiàn)為鈍性疼痛，逐漸進(jìn)展為中至重度的持續(xù)痛并伴有爆發(fā)痛，嚴(yán)重影響

2、患者的生活質(zhì)量。隨著診療技術(shù)的發(fā)展，癌癥患者的生存率顯著增加，因此惡性腫瘤導(dǎo)致的骨骼疼痛成為迫切需要解決的問題之一，然而骨癌痛的發(fā)病機(jī)制目前所知有限，極大地阻礙了對(duì)骨癌痛的有效治療。
　　研究發(fā)現(xiàn)，慢性疼痛的發(fā)生是以基因背景為基礎(chǔ)，與個(gè)體所處客觀環(huán)境相互作用的結(jié)果，其中的候選基因包括HLA。脊髓是慢性疼痛發(fā)生中樞敏化的關(guān)鍵部位，研究發(fā)現(xiàn)，主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（Major Histocompatibility ClassⅡ，MHC

3、Ⅱ）高表達(dá)于慢性疼痛動(dòng)物的脊髓背角，抑制該分子表達(dá)能夠顯著改善神經(jīng)損傷導(dǎo)致的異常疼痛和痛覺超敏。據(jù)此推測(cè)MHCⅡ可能是介導(dǎo)慢性疼痛中樞敏化的分子之一，然而該分子在骨癌痛發(fā)生中的作用目前所知甚少。
　　JAK/STAT1信號(hào)通路執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活兩個(gè)方面的功能，在抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)參與啟動(dòng)CⅡTA（MHC ClassⅡ Transactivator，CⅡTA）的轉(zhuǎn)錄，而CⅡTA又調(diào)控MHCⅡ的表達(dá)，因此，JAK/STAT1信

4、號(hào)通路是調(diào)控MHCⅡ表達(dá)的重要因素，抑制該通路后有可能緩解骨癌痛癥狀。MEK/ERK信號(hào)通路是參與小膠質(zhì)細(xì)胞激活的MAPK成員之一，主要執(zhí)行小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和促炎性介質(zhì)的釋放，研究指出，
　　JAK/STAT1與MEK/ERK信號(hào)通路之間存在著相互聯(lián)系，據(jù)此我們提出研究假說(shuō)：脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞JAK/STAT1信號(hào)通路激活，通過調(diào)控CⅡTA的表達(dá)導(dǎo)致MHCⅡ分子表達(dá)上調(diào)并參與骨癌痛的發(fā)生；此外，MEK/ERK信號(hào)通路與JAK/ST

5、AT1信號(hào)通路之間存在相互聯(lián)系。
　　1、MHCⅡ參與骨癌痛發(fā)生
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：選擇健康成年雌性健康SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和骨癌痛組，建立骨癌痛大鼠模型，分別在模型建立前和模型建立后3、7、10、14和21 d測(cè)定手術(shù)側(cè)肢體的機(jī)械性縮爪閾值（Mechanical Paw Withdrawal Threshold，MPWT），利用Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)MHCⅡ及其調(diào)控分子CⅡTA在

6、脊髓的表達(dá)變化情況。
　　實(shí)驗(yàn)二：建立骨癌痛大鼠動(dòng)物模型，鞘內(nèi)注射米諾環(huán)素或者脊髓微注射LV-CⅡta-RNAi定向沉默CⅡTA，觀察下調(diào)MHCⅡ表達(dá)后大鼠疼痛行為的變化，免疫熒光染色觀察慢病毒在脊髓背角的轉(zhuǎn)染效果，RT-PCR驗(yàn)證LV-CⅡta-RNAi沉默 CⅡTA情況；選擇LV-CⅡta-RNAi及陰性對(duì)照慢病毒干擾的骨癌痛大鼠和正常大鼠，鞘內(nèi)注射重組大鼠IFNγ誘導(dǎo)MHCⅡ表達(dá)上調(diào)，并驗(yàn)證LV-CⅡta-RNAi沉默CⅡT

7、A的效果。Western blot檢測(cè)干預(yù)后CⅡTA和MHCⅡ在脊髓的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　骨癌痛組大鼠在模型建立后7、14和21 d表現(xiàn)為典型的異常疼痛，同時(shí)CⅡTA和MHCⅡ的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。鞘內(nèi)注射米諾環(huán)素或脊髓微注射LV-CⅡta-RNAi均能夠顯著抑制MHCⅡ的表達(dá)上調(diào)，并明顯改善骨癌痛癥狀。鞘內(nèi)注射重組大鼠IFNγ能誘導(dǎo)MHCⅡ在陰性對(duì)照病毒注射的骨癌痛大鼠和正常大鼠脊髓的表達(dá)上調(diào)，對(duì)LV-CⅡta-

8、RNAi干擾的骨癌痛大鼠無(wú)顯著影響。
　　2、JAK/STAT1和MEK/ERK信號(hào)通路激活并參與骨癌痛發(fā)生方法
　　研究方法與結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一：選擇健康成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和骨癌痛組，建立骨癌痛大鼠模型，分別在模型建立前和模型建立后3、7、10、14和21 d測(cè)定手術(shù)側(cè)肢體的MPWT，利用Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)pSTAT1和pERK在脊髓的表達(dá)變化情況。
　　實(shí)驗(yàn)二：建

9、立骨癌痛大鼠模型，鞘內(nèi)注射JAK抑制劑AG490、STAT1抑制劑Fludarabine和MEK抑制劑U0126，每日1次；分別在模型建立前和建立后3、7、10和14 d觀察手術(shù)側(cè)肢體的MPWT；于手術(shù)后14 d安樂死大鼠取脊髓腰膨大，利用Western blot檢測(cè)pSTAT1、pERK、CⅡTA和MHCⅡ的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　骨癌痛大鼠脊髓的pSTAT1和pERK的表達(dá)水平顯著上調(diào)。鞘內(nèi)注射Fludarbine和

10、U0126能夠顯著地抑制pSTAT1、pERK、CⅡTA和MHCⅡ的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)顯著性地改善骨癌痛的MPWT下調(diào)，而AG490對(duì)上述作用有限。
　　3、JAK/STAT1和MEK/ERK信號(hào)通路激活介導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞MCHⅡ的表達(dá)方法
　　體外培養(yǎng)出生24 h內(nèi)大鼠大腦皮層的原代小膠質(zhì)細(xì)胞，重組大鼠IFNγ誘導(dǎo)JAK/STAT1和MEK/ERK信號(hào)通路激活；干預(yù)組在IFNγ刺激前30 min分別加入AG490、Fludar

11、abine和U0126，24 h后提取細(xì)胞總蛋白，利用Western blot檢測(cè)pSTAT1、pERK、CⅡTA和MHCⅡ蛋白表達(dá)水平的變化情況。
　　結(jié)果：
　　IFNγ能夠顯著地激活JAK/STAT1和MEK/ERK信號(hào)通路，同時(shí)導(dǎo)致CⅡTA和MHCⅡ的表達(dá)顯著上調(diào)；抑制劑Fludarabine或U0126分別顯著抑制JAK/STAT1或MEK/ERK信號(hào)通路激活，但均能夠抑制CⅡTA和MHCⅡ的表達(dá)上調(diào)，其中U012

12、6能夠抑制 STAT1的磷酸化激活，而Fludarabine對(duì)ERK的磷酸化水平無(wú)顯著影響；AG490對(duì)上述通路激活的抑制作用相對(duì)有限。
　　4、統(tǒng)計(jì)分析
　　數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以?x±SEM表示；兩個(gè)變量之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多個(gè)變量的比較采用one-way ANOVA，組間行為學(xué)結(jié)果
　　分析采用two-way ANOVA；統(tǒng)計(jì)結(jié)果的圖片制作采用GraphPad prism5，

13、p<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究總結(jié)：
　　1、主要研究結(jié)果
　　1.1骨癌痛大鼠脊髓MHCⅡ表達(dá)上調(diào)，特異地表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞；鞘內(nèi)注射小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑或脊髓微注射慢病毒定向沉默CⅡTA基因，能顯著降低MHCⅡ的表達(dá)水平，并顯著改善大鼠的骨癌痛癥狀；
　　1.2骨癌痛大鼠脊髓信號(hào)通路JAK/STAT1和MEK/ERK激活，磷酸化激活性的pSTAT1和pERK表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞；鞘內(nèi)注射抑

14、制劑能顯著抑制信號(hào)通路，并抑制MHCⅡ的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)顯著緩解骨癌痛大鼠的痛覺異常；
　　1.3重組大鼠IFNγ刺激體外培養(yǎng)的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞，能夠激活信號(hào)通路JAK/STAT1和MEK/ERK，并誘導(dǎo)MHCⅡ的表達(dá)水平上調(diào)；抑制信號(hào)通路激活能夠顯著抑制MHCⅡ的表達(dá)。
　　2、研究結(jié)論
　　2.1骨癌痛大鼠的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ并介導(dǎo)骨癌痛發(fā)生；2.2JAK/STAT1是調(diào)節(jié)MHCⅡ表達(dá)的重要信號(hào)通路；

15、>　　2.3小膠質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)通路MEK/ERK對(duì)JAK/STAT1有單向調(diào)控作用。
　　3、創(chuàng)新之處
　　3.1首次揭示了MCHⅡ分子在骨癌痛發(fā)生中的作用；3.2首次發(fā)現(xiàn)JAK/STAT1信號(hào)通路參與骨癌痛發(fā)生；
　　3.3揭示了骨癌痛病理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)通路MEK/ERK對(duì)JAK/STAT1的單向調(diào)控作用。
　　4、展望
　　4.1本研究發(fā)現(xiàn)MHCⅡ表達(dá)于骨癌痛大鼠脊髓的小膠質(zhì)細(xì)胞，可能是骨癌痛治

16、療的新靶點(diǎn)，然而MHCⅡ分子是否參與抗原遞呈功能并誘導(dǎo)外周的CD4+T細(xì)胞遷移進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，二者相互作用導(dǎo)致脊髓的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與骨癌痛病理過程。
　　目前仍然不明確，需要在將來(lái)的工作中進(jìn)一步研究；
　　4.2該研究證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)通路JAK/STAT1和MEK/ERK激活，誘導(dǎo)MHCⅡ表達(dá)并參與骨癌痛發(fā)生，揭示了骨癌痛形成的信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制，然而上述信號(hào)通路介導(dǎo)的生物學(xué)功能復(fù)雜，二者之間存在密切聯(lián)系，在揭示其