脊髓水平mLin10-PDZ1結(jié)構(gòu)域在小鼠骨癌痛維持中的作用.pdf

1、目的：探討鞘內(nèi)單次注射nLin10-PDZ1結(jié)構(gòu)域小肽抑制劑對骨癌痛小鼠的痛行為的影響以及脊髓水平mLin10-PDZ1結(jié)構(gòu)域在小鼠骨癌痛維持中的作用。
　　方法：124只雄性C3H/HeJ小鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為正常組（N組，n=3）、假手術(shù)組(S組，n=17)和腫瘤組(T組，n=104)。將含2×105個NCTC2472纖維肉瘤細胞的最小必需培養(yǎng)基(α-MEM)接種到T組小鼠右側(cè)股骨遠端骨髓腔內(nèi)，制作骨癌痛模型;S組小鼠骨髓

2、腔內(nèi)注入不含腫瘤細胞的α-MEM;正常組小鼠不做任何處理。T組及S組于接種前1d、接種后3d、5d、7d、10d、14 d測定痛行為學(xué)指標(biāo):自發(fā)性抬足次數(shù)、機械痛縮足閾值(PWMT)。T組小鼠在接種后14 d，進一步隨機分為溶媒組(C組，n=14)、mLin10-PDZ1結(jié)構(gòu)域小肽抑制劑Myr-RC-13組(R組，n=36)及其同分異構(gòu)體小肽Myr-WP-13組(W組，n=36)。R組按照不同藥物劑量進一步分為R1(n=8)、R2組(n

3、=8)、R3組(n=20)，分別鞘內(nèi)注射小肽Myr-RC-132.5μg、5μg、10μg;W組按照不同藥物劑量進一步分為W1組(n=8)、W2組(n=8)、W3組(n=20)，分別鞘內(nèi)注射Myr-WP-132.5μg、5μg、10μg。小肽均溶于10％二甲基亞砜(DMSO)，S組和C組鞘內(nèi)注射溶媒10％ DMSO。注射體積均為5μl。在給藥后的2h、12h、24 h分別測定各組小鼠的痛行為學(xué)指標(biāo)。在第14 d給藥前，取正常組、S組及T

4、組小鼠脊髓腰膨大L3-5節(jié)段采用免疫共沉淀檢測KIF17與mLin10相互作用。在給藥后2h,C組、W3及R3組小鼠取脊髓腰膨大L3-5節(jié)段進行免疫共沉淀檢測KIF17與mLin10相互作用。選取接種前1d、接種后5d、7d、10d、14d和給藥后2h、12h、24 h的小鼠取L3-5節(jié)段脊髓腰膨大保存于-80℃冰箱，采用western blot方法檢測脊髓KIF17與NR2B蛋白表達水平。
　　結(jié)果：(1)痛行為學(xué)變化:①與S組

5、和術(shù)前基礎(chǔ)值相比，T組小鼠在接種腫瘤細胞后第7d出現(xiàn)PWMT明顯下降[(1.25±0.21)g，F(xiàn)=12.11，P＜0.01]，自發(fā)性抬足次數(shù)明顯增加[(4.38±0.98), F=27.70，P＜0.01]，并隨時程變化逐漸明顯，于術(shù)后14d其PWMT值降低至[(0.42±0.07)g，F(xiàn)=260.986，P＜0.01]，自發(fā)抬足次數(shù)增加至[(13.46±1.44)，F(xiàn)=117.473，P＜0.01]。②鞘內(nèi)給予小肽Myr-RC-13

6、后2h，與C組比較，R1、R2和R3組PWMT增高[(0.70±0.18)g，(0.85±0.21)g，(1.25±0.21)g，F(xiàn)=62.184，P＜0.01]，自發(fā)性抬足次數(shù)減少[(10.40±1.52)，(9.28±1.36)，(7.55±0.67)，F(xiàn)=59.807，P＜0.01]， R3組較R1和R2組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01），但各組均未能恢復(fù)至假手術(shù)組水平。至12h，與C組相比，R2和R3組PWMT值[(0.7±0.18

7、)g，(1.05±0.33)g，F(xiàn)=82.641，P＜0.01]有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，R3組自發(fā)抬足次數(shù)減少[(9.53±1.40)，P＜0.01];而R1組各痛行為學(xué)變化無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05）。在給藥后24 h，R組各組小鼠PWMT值及自發(fā)抬足次數(shù)與S組、C組相比則無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。而鞘內(nèi)給予同分異構(gòu)體Myr-WP-13，與C組相比，在各時間點小鼠痛行為無變化（P＞0.05）。
　　(2) western blot

8、結(jié)果示:與S組相比，從接種后第5d開始，T組小鼠KIF17和NR2B表達水平增高。鞘內(nèi)給予Myr-RC-13后2h，12h、24 h，R3組脊髓L3-5節(jié)段NR2B及KIF17蛋白水平均較S組及C組明顯下降(P＜0.05），而W3組則與給藥前無明顯變化(P＞0.05）。Co-immunoprecipitation結(jié)果顯示，與正常組及S組小鼠比較，腫瘤組小鼠mLin10與KIF17相互作用增強(P＜0.05），鞘內(nèi)注射小肽Myr-RC-1