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文檔簡介
1、軸周蛋白(Periaxin)是成髓鞘的施萬細胞和晶狀體纖維細胞中特異且大量表達的一種細胞骨架相關(guān)蛋白。Periaxin參與髓鞘中PDG復(fù)合物的形成,是Cajal條帶存在的分子基礎(chǔ),一旦L-periaxin突變或缺失會引起過度髓鞘化或脫髓鞘現(xiàn)象。Periaxin的定位在髓鞘的形成過程中是不斷變化的,從最初的細胞核到最后的遠離軸突的質(zhì)膜處。Periaxin可以編碼含有PDZ結(jié)構(gòu)域的兩種蛋白亞型,分別為L-periaxin和S-periaxi
2、n。PDZ結(jié)構(gòu)域在Periaxin定位和PDG復(fù)合物形成中具有重要作用,但與其結(jié)合的配體卻未見報道。EphrinB2是受體酪氨酸激酶家族的一個成員。EphrinB2配體可以和其對應(yīng)的受體EphB2之間形成雙向信號,這種信號可以直接指導(dǎo)軸突的生長、細胞的聚集和遷移、髓鞘的形成。EphrinB2配體包括胞外區(qū),跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),在C端包含有PDZ結(jié)合基序。通過結(jié)合PDZ協(xié)調(diào)組織細胞膜上的蛋白復(fù)合物。
本文對L-periaxin與Ep
3、hrinB2間的相互作用進行了分析。首先,免疫熒光共定位實驗結(jié)果表明了L-periaxin與EphrinB2在細胞質(zhì)和細胞膜上有共定位現(xiàn)象。之后對L-periaxin與EphrinB2之間的相互作用進一步驗證,結(jié)果顯示L-periaxin與EphrinB2之間存在相互作用。為了確定EphrinB2與L-periaxin的互作的具體區(qū)域,對L-periaxin的四個不同的結(jié)構(gòu)域分別利用雙分子熒光互補實驗、海腎熒光素酶互補實驗及免疫共沉淀實
4、驗去分析與EphrinB2間的相互作用,結(jié)果表明L-periaxin的 PDZ結(jié)構(gòu)域與 EphrinB2之間存在著相互作用。將EphrinB2的PDZ結(jié)合基序去掉之后,這種相互作用消失。S-periaxin與L-periaxin有著同樣的PDZ結(jié)構(gòu)域,通過雙分子熒光互補實驗(BiFC)、海腎熒光素酶互補實驗、免疫共沉淀實驗、GST Pull-down實驗的檢測,也證實S-periaxin的PDZ結(jié)構(gòu)域與EphrinB2的相互作用。
5、> 實驗室前期研究揭示L-periaxin可以通過其分子內(nèi)NLS2,3結(jié)構(gòu)域與酸性結(jié)構(gòu)域的相互作用形成首尾自環(huán)結(jié)構(gòu),而DRP2與L-periaxin的NLS2,3的結(jié)合會減弱L-periaxin的分子內(nèi)的首尾相互作用。本文通過DRP2的干擾實驗,體外NLS3多肽孵育施萬細胞,結(jié)合雙分子熒光互補實驗,揭示DRP2及NLS3合成多肽片段可以競爭性結(jié)合L-periaxin的NLS結(jié)構(gòu)域,從而破壞L-periaxin之間的分子內(nèi)的相互作用,免
6、疫熒光定位揭示L-periaxin的分子由閉環(huán)到開環(huán)的狀態(tài)改變,引起L-periaxin細胞膜定位數(shù)量的增加。
最后,為了檢測L-periaxin是否影響RSC96細胞的增殖,利用MTT法及流式細胞術(shù)對敲除L-periaxin及過表達L-periaxin后對RSC96細胞的增殖的影響進行了研究。結(jié)果顯示敲除了L-periaxin基因的細胞增殖速度減慢,G1期細胞的比例比正常細胞增加了18.16%, S期減少了20.62%。說明
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