Y盒結(jié)合蛋白-1C末端結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)血管新生的機制研究.pdf

1、目的：近年來，乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病率居于女性惡性腫瘤的首位，對世界女性健康造成嚴(yán)重威脅。血管新生過程是腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抗血管新生治療也廣泛應(yīng)用于臨床，抗血管生成藥物日新月異。Y盒結(jié)合蛋-1（Y-box binding protein-1，YB-1）作為體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在包括基因轉(zhuǎn)錄、RNA剪切及mRNA翻譯、DNA修復(fù)、細(xì)胞增殖等多個過程中均發(fā)揮重要作用，并在肺癌、結(jié)腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)，并與腫

2、瘤增殖、耐藥密切相關(guān)，且有研究表明其可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，但其調(diào)節(jié)腫瘤血管新生的機制有待進(jìn)一步研究。本研究通過構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體，并用腺病毒液感染EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞旨在探究冷休克蛋白家族成員YB-1蛋白C末端結(jié)構(gòu)域（YB-1 C-terminal domain，YB-1 CTD）對血管新生的調(diào)節(jié)機制，為抗血管新生靶向治療提供理論依據(jù)。
　　方法：構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體，用GFP和GFP-YB-1 CTD腺病毒液感染EA.hy

3、926內(nèi)皮細(xì)胞，MTS法檢測GFP和GFP-YB-1 CTD對細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測YB-1 CTD對細(xì)胞周期的影響；Western blot檢測YB-1 CTD對EA.hy926細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、cyclin B1的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)；RT-PCR檢測YB-1 CTD對p21、cyclin B1 mRNA表達(dá)的影響；跨膜遷移實驗評價YB-1 CTD對EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響；血管內(nèi)皮成環(huán)實驗檢測YB-1

4、 CTD對EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞血管成環(huán)特性的影響；ELISA檢測YB-1CTD對SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞分泌VEGF的調(diào)節(jié)；檢測細(xì)胞骨架染色觀察YB-1CTD對EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架的分布及狀態(tài)的影響。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)± s）表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，均數(shù)比較采用t檢驗或單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果： MTS法檢測細(xì)胞增殖顯

5、示，轉(zhuǎn)染GFP-YB-1 CTD48小時后，EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞增殖均受到抑制；流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測細(xì)胞周期結(jié)果提示YB-1 CTD可調(diào)節(jié)EA.hy926細(xì)胞周期阻滯在G1期；Western blot免疫印跡分析顯示與GFP對照組相比，GFP-YB-1 CTD能上調(diào)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá)水平，并下調(diào)cyclin B1蛋白的表達(dá)水平；實時定量PCR結(jié)果提示，在mRNA水平，YB-1CTD

6、促進(jìn)p21的表達(dá)，而抑制cyclin B1的表達(dá)；跨膜遷移實驗可見GFP組較GFP-YB-1 CTD組跨膜遷移的細(xì)胞數(shù)多；鬼筆環(huán)肽細(xì)胞骨架染色觀察到GFP組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中含有大量平行束狀分布的應(yīng)力纖維，且纖維粗大，沿細(xì)胞長軸分布，GFP-YB-1 CTD組，未見明顯的纖維束，微絲解聚并且彌散地分布于胞質(zhì)中，血管內(nèi)皮成環(huán)實驗結(jié)果顯示，在40倍顯微鏡下，GFP組血管內(nèi)皮成環(huán)數(shù)量多，血管環(huán)完整，在Metrigel膠表面較均勻分布，

7、延長培養(yǎng)時間血管環(huán)穩(wěn)定，不易破碎，GFP-YB-1 CTD組內(nèi)皮細(xì)胞不易成環(huán)，或者部分成環(huán)，血管環(huán)不完整，成條索狀結(jié)構(gòu)；在100倍顯微鏡下觀察GFP組能明顯觀察到EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞伸展、延長，相鄰的細(xì)胞可以連接呈環(huán)狀。GFP-YB-1 CTD組EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞部分伸展，部分呈球狀，僅有少數(shù)細(xì)胞可以產(chǎn)生相互連接，形成類似于“肝索”樣的細(xì)胞條索，而不是完整的血管環(huán)。ELISA法檢測SK-BR-3細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的VEG

8、F含量結(jié)果顯示，與GFP對照組相比，GFP-YB-1 CTD組條件培養(yǎng)基中VEGF含量低。SK-BR-3細(xì)胞條件培養(yǎng)基刺激條件下的血管成環(huán)結(jié)果顯示，GFP組血管內(nèi)皮成環(huán)數(shù)量多、血管環(huán)完整、周長較長，延長培養(yǎng)時間，血管環(huán)穩(wěn)定，GFP-YB-1 CTD組內(nèi)皮幾乎不成環(huán)或者少數(shù)成環(huán)，成環(huán)局限、不完整且不穩(wěn)定易破碎。
　　結(jié)論： YB-1 CTD抑制EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞及SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞增殖，影響EA.hy926遷移和成環(huán)能力