血管生成素樣蛋白3及不同結(jié)構(gòu)域影響足細(xì)胞骨架重排的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　大量蛋白尿是腎病綜合征的特征性表現(xiàn)，也是直接影響腎臟疾病進(jìn)展的獨立危險因素，其產(chǎn)生與足細(xì)胞廣泛足突融合有關(guān)。擁有大量的足突是足細(xì)胞形態(tài)學(xué)的突出特點，這一結(jié)構(gòu)由足細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白細(xì)胞骨架所維系。病理情況下的足細(xì)胞運動能力增加、肌動蛋白細(xì)胞骨架重排是足突廣泛融合消失及大量蛋白尿發(fā)生的基礎(chǔ)。
　　足細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白受到諸多分子的精密調(diào)控，分布于足細(xì)胞基底膜面的整合素家族在其中起重要作用。Rho家族小GTP酶成員，特別是

2、RhoA，Rac1和Cdc42，可以將膜蛋白的分子信號傳遞到肌動蛋白纖維，被公認(rèn)為細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)過程的分子開關(guān)。
　　血管生成素樣蛋白3（Angiopoietin-like3，Angptl3）是一種分泌蛋白，正常情況下腎臟僅微量表達(dá)，而在多種以蛋白尿為主要表現(xiàn)的腎臟疾病中表達(dá)量顯著增多。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞分泌的Angptl3參與了蛋白尿的發(fā)生，且體外實驗證實上調(diào)足細(xì)胞Angptl3表達(dá)可以增強(qiáng)足細(xì)胞活動能力。預(yù)實驗中我們也發(fā)

3、現(xiàn)，重組Angptl3分子干預(yù)可使足細(xì)胞發(fā)生明顯的肌動蛋白細(xì)胞骨架重排，這一過程的具體分子機(jī)制尚不清楚;Angptl3有螺旋樣結(jié)構(gòu)域(Coiled-coildomain，CCD)和纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域(Fibrinogen-like domain，F(xiàn)LD)兩個不同結(jié)構(gòu)域，這是Angptl3具有多種生物學(xué)作用的基礎(chǔ)。這兩個結(jié)構(gòu)域是否都參與了對足細(xì)胞的影響，目前尚不明確。本課題分兩部分分別解決以上兩個問題。
　　第一部分血管生成素樣蛋白

4、3通過小GTP酶影響足細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架重排的分子機(jī)制研究
　　研究目的:探討Angptl3引起足細(xì)胞肌動蛋白纖維重排的主要表現(xiàn)及分子機(jī)制。
　　方法:(1)免疫熒光染色檢測細(xì)胞株WT-1及podocin的表達(dá)，鑒定足細(xì)胞株;
　　(2)重組Angptl3分子干預(yù)培養(yǎng)足細(xì)胞，以熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對足細(xì)胞肌動蛋白纖維染色，熒光顯微觀察肌動蛋白骨架重排情況;
　　(3)重組Angptl3分子干預(yù)培養(yǎng)足細(xì)胞，以G-

5、LISATM方法檢測足細(xì)胞小GTP酶的激活情況;
　　(4)阻斷劑阻斷可被Angptl3活化的小GTP酶，觀察Angptl3引起的肌動蛋白骨架重排現(xiàn)象是否消失;
　　(5)阻斷整合素αvβ3，然后應(yīng)用重組Angptl3干預(yù)培養(yǎng)足細(xì)胞，觀察是否可以阻斷足細(xì)胞骨架重排、檢測是否可以阻斷小GTP酶的激活;
　　(6)分別阻斷整合素αvβ3的下游關(guān)鍵分子FAK和PI3K，觀察是否可以阻斷Angptl3引起的足細(xì)胞肌動蛋白骨架重

6、排及小GTP酶激活，并應(yīng)用Western Blot檢測可能的下游分子的磷酸化水平變化，以明確可能的分子通路;
　　(7)以WesternBlot檢測Angptl3干預(yù)后小GTP酶的表達(dá)水平變化，明確Angptl3是否可以影響小GTP酶的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)足細(xì)胞株WT-1及podocin表達(dá)均呈陽性，可用于實驗;
　　(2) Angptl3可使足細(xì)胞出現(xiàn)明顯的肌動蛋白細(xì)胞骨架重排，主要表現(xiàn)為板狀偽足和細(xì)胞棘的生成;

7、
　　(3) Angptl3可激活足細(xì)胞中的小GTP酶Rac1和RhoA，其中Rac1活化程度較強(qiáng)、持續(xù)時間長，RhoA僅存在一個瞬時、低水平的活化;
　　(4)阻斷Rac1可阻斷Angptl3引起的足細(xì)胞板狀偽足的生成;
　　(5)阻斷整合素αvβ3可阻斷Angptl3引起的足細(xì)胞肌動蛋白纖維重排及阻斷小GTP酶激活;
　　(6)阻斷FAK或PI3K均可阻斷Angptl3引起的足細(xì)胞板狀偽足的生成及并阻斷Rac

8、1的激活;Angptl3可使足細(xì)胞FAK、PI3K的磷酸化水平增高;阻斷整合素αvβ3可阻斷Angptl3引起的FAK、PI3K磷酸化;阻斷FAK可阻斷Angptl3引起的PI3K的磷酸化;
　　(7) Angptl3可引起足細(xì)胞Rac1表達(dá)水平的增加，不影響RhoA及Cdc42表達(dá)。
　　結(jié)論:(1) Angptl3可以引起足細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架重排，主要作用為促進(jìn)板狀偽足生成;
　　(2) Rac1和RhoA的激活

9、，特別是Rac1激活，是Angptl3引起足細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架重排的基礎(chǔ);
　　(3) Angplt3引起足細(xì)胞板狀偽足生成通過整合素αvβ3-FAK-PI3K-Rac1途徑;
　　(4)足細(xì)胞可增加Rac1的表達(dá)。
　　第二部分血管生成素樣蛋白3不同結(jié)構(gòu)域?qū)ψ慵?xì)胞肌動蛋白纖維重排及足細(xì)胞失黏附損傷的影響
　　研究目的:明確Angptl3不同結(jié)構(gòu)域?qū)ψ慵?xì)胞肌動蛋白骨架重排的影響;探討Angptl3對嘌呤霉素氨基

10、核苷(Puromycin aminonucleoside，PAN)引起的足細(xì)胞失黏附的影響，及各個結(jié)構(gòu)域在其中的作用
　　方法:(1)應(yīng)用重組Angptl3-CCD分子片段、Angptl3-FLD分子片段以及重組完整Angptl3分子干預(yù)培養(yǎng)足細(xì)胞，分別觀察其對足細(xì)胞肌動蛋白纖維重排情況的影響;
　　(2)應(yīng)用重組Angptl3分子分別按濃度和時間梯度干預(yù)培養(yǎng)足細(xì)胞，之后給予PAN處理足細(xì)胞，應(yīng)用Hexosaminidase

11、 Assay觀察Angptl3對PAN引起的足細(xì)胞失黏附情況的影響;應(yīng)用重組Angptl3-CCD分子片段、Angptl3-FLD分子片段預(yù)處理足細(xì)胞，繼給予PAN處理，觀察Angptl3各個結(jié)構(gòu)域?qū)AN引起的足細(xì)胞失黏附情況的影響。
　　結(jié)果:(1)僅Angptl3-FLD可引起足細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架重排，且與Angptl3完整分子處理時等效;
　　(2) Angptl3預(yù)處理后，足細(xì)胞較對照組失黏附情況明顯減輕;且失黏

12、附的減輕程度隨處理時間的延長及處理劑量的加大而明顯;Angptl3-FLD分子片段干預(yù)的結(jié)果與完整Angptl3分子干預(yù)相類似，隨干預(yù)時間的延長足細(xì)胞失黏附情況較前減輕;Angptl3-CCD分子片段干預(yù)時，足細(xì)胞表現(xiàn)出失黏附情況先加重后減輕的情況。
　　結(jié)論:(1) FLD片段是Angptl3引起足細(xì)胞肌動蛋白骨架重排的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域;CCD片段不參與Angptl3對足細(xì)胞肌動蛋白骨架重排的影響;
　　(2) Angptl3可