ROS對(duì)仔豬支持細(xì)胞骨架的影響及機(jī)制研究.pdf

1、睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell,SC)對(duì)于成年動(dòng)物精子的生成量具有決定性影響，所有針對(duì)睪丸的毒物均以支持細(xì)胞作為第一作用對(duì)象。睪丸支持細(xì)胞骨架參與了血睪屏障的形成、精子的釋放及物質(zhì)的運(yùn)輸?shù)壬砘顒?dòng)，研究氧化應(yīng)激對(duì)支持細(xì)胞骨架的影響，不僅可以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)精子生成的調(diào)節(jié)機(jī)制，而且能闡明活性氧導(dǎo)致雄性不育的機(jī)制，為治療雄性不育提供依據(jù)和新的思路。本實(shí)驗(yàn)以仔豬睪丸支持細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，利用H2O2、細(xì)胞松弛素(CytB)模擬細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激

2、環(huán)境，研究了活性氧對(duì)細(xì)胞骨架的影響及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。 為了建立合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，本研究首先研究了H2O2對(duì)細(xì)胞骨架的影響。通過(guò)急性實(shí)驗(yàn)，確定H2O2處理的半數(shù)致死量(LD50)為617.5μmol/L。利用熒光分光光度計(jì)和熒光探針檢測(cè)H2O2處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS水平和超氧化物陰離子的水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2處理明顯增加ROS和超氧化物陰離子的水平(p＜0.05)。為了檢測(cè)ROS對(duì)細(xì)胞的影響，本實(shí)驗(yàn)用投射電鏡對(duì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)

3、行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體發(fā)生腫脹，染色質(zhì)凝集，胞漿濃縮和核溢裂的現(xiàn)象并且空泡化特別明顯。進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的微絲應(yīng)力纖維網(wǎng)和微絲束被破壞，出現(xiàn)微絲邊集合。 本實(shí)驗(yàn)還利用細(xì)胞松弛素(CytB)模擬細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激環(huán)境。結(jié)果顯示，隨著濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平顯著升高(p＜0.05)，且DHE染色后，光密度變化也與ROS變化趨勢(shì)一致。利用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CytB濃度分別為0.1gmol/L及0.5gmol/L時(shí)

4、，微絲出現(xiàn)聚集現(xiàn)象但細(xì)胞形態(tài)完整；當(dāng)濃度達(dá)到1.5μmol/L，時(shí)，微絲出現(xiàn)斷裂，甚至都成碎片，呈彌散狀。 為了研究細(xì)胞松弛素(CytB)冪H2O2在對(duì)細(xì)胞的影響中是否存相互作用，本實(shí)驗(yàn)還研究了二者共同作用對(duì)微絲的影響。結(jié)果顯示在本實(shí)驗(yàn)中兩者是協(xié)同作用。在添加VE后，可以削弱它們的影響。 為了研究ROS調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)還研究了Sertoli細(xì)胞抗氧化能力和MAPK級(jí)聯(lián)活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞松弛素(CytB

5、)、H2O2和二者共同作用均使SOD、GSH、CAT等水平顯著下降，加入VE后幾種酶的活性明顯上升。細(xì)胞松弛素和H2O2均激活了ERK1/2和P38，加AVE抑制了ERK1/2和P38的激活。 綜上所述，本研究所得結(jié)論如下： (1)細(xì)胞松弛素和H2O2引起Sertoli細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，使細(xì)胞活力顯著下降； (2)細(xì)胞松弛素和H2O2對(duì)F-actin的分布有影響； (3)細(xì)胞松弛素和H2O2誘導(dǎo)的