不同固定液對(duì)細(xì)胞骨架熒光染色標(biāo)記效果的影響

1、不同固定液對(duì)細(xì)胞骨架熒光染色標(biāo)記效果的影響羅果，保玉心，李晉（563003貴州遵義，遵義醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室）[摘要]目的目的比較不同固定液對(duì)細(xì)胞骨架熒光染色的差異，選擇最佳固定方法。方法方法分別采用4%甲醛、2%戊二醛、95%乙醇和4%多聚甲醛MES4種固定液，對(duì)人肺腺癌細(xì)胞H1299進(jìn)行固定，對(duì)其微管和微絲熒光標(biāo)記后，在共聚焦顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果結(jié)果4%多聚甲醛MES對(duì)細(xì)胞的微管和微絲都有很好的固定作用。4%甲醛、2%戊二醛、9

2、5%乙醇對(duì)細(xì)胞的微絲基本能起到固定作用，而4%甲醛對(duì)微管的固定效果略差，2%戊二醛、95%乙醇固定的細(xì)胞看不到微管的具體形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)論結(jié)論細(xì)胞骨架的固定中需加入骨架穩(wěn)定劑，且根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ韩@得最佳標(biāo)記效果。[關(guān)鍵詞]細(xì)胞骨架；激光共聚焦顯微鏡；H1299細(xì)胞；熒光染色[中圖法分類號(hào)][文獻(xiàn)標(biāo)志碼]B激光共聚焦顯微鏡是研究細(xì)胞骨架的最佳儀器[1]。從形態(tài)觀察、定位、定量到分子結(jié)構(gòu)與功能調(diào)節(jié)以及病理變化等各方面對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行

3、研究，成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)中重要課題[24]。共聚焦樣本的制備包括樣本的預(yù)處理和熒光標(biāo)記2個(gè)主要步驟，樣本制備的好壞直接決定實(shí)驗(yàn)的成功與否。MES是一種具有較高去污力的表面活性劑，生物溶解性能好，工業(yè)上常用于液體洗滌中作活性物、分散劑等，在細(xì)胞生物領(lǐng)域中常用作某些組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定劑，本實(shí)驗(yàn)中采用4種常用細(xì)胞固定液，同時(shí)結(jié)合2(N嗎啉基)乙磺酸（MES），分別固定人肺腺癌細(xì)胞H1299，并對(duì)其微管和微絲進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過激光共聚焦圖像的觀察和分

4、析，探討不同固定液對(duì)細(xì)胞骨架的影響，選擇最佳固定方法。1材料與方法1.1材料、試劑和儀器人肺腺癌細(xì)胞系H1299：由我校生化教研室范芳副教授惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(四季青生物公司)，PhalloidinTRITC(Sigma公司)，鼠抗人βtubulin(USBiological公司)，羊抗鼠IgGFITC(SantaCruz公司)，多聚甲醛(Sigma公司)，MES(Solarbio公司)，TritonX10

5、0(Solarbio公司)。激光共聚焦顯微鏡(LeicaSP2)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)。1.2H1299細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇液氮凍存的H1299細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化成單個(gè)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2?104ml，接種于Petri皿中，培養(yǎng)12h，待其貼壁后用于實(shí)驗(yàn)。1.3H1299細(xì)胞的固定

6、取出Petri皿，分別用4%甲醛、2%戊二醛、95%乙醇和4%多聚甲醛MES對(duì)Petri皿中的細(xì)胞進(jìn)行固定，具體方法[59]如下：①4%甲醛固定：Petri皿中的細(xì)胞用PBS沖洗3次，用4℃預(yù)冷的4%甲醛室溫固定20min②2%戊二醛固定：Petri皿中的細(xì)胞用PBS沖洗3次用2%戊二醛室溫固定15min，再用1gL的NaBH4洗3次，每次4min③95%乙醇固定：Petri皿中的細(xì)胞用PBS沖洗3次，用95%乙醇室溫固定30min；④

7、4%多聚甲醛MES固定：Petri皿中的細(xì)胞用37℃預(yù)熱的MES(MES90mmolLMgCl22mmolLEDTA1.5mmolLPEG80005mmolL)沖洗3次，用4%多聚甲醛MES室溫固定20min，再用37℃預(yù)熱的MES沖洗3次。1.4間接免疫熒光法標(biāo)記細(xì)胞微管將固定好的細(xì)胞用0.5%TritonPBS洗滌3次、每次10min，加入鼠抗人βtubulin，37℃孵育1h，再用0.5%TritonPBS洗滌3次、每次10min

8、，加入羊抗鼠IgGFITC，37℃孵育1h，用0.5%TritonPBS洗滌3次、每次10min[10]。1.5直接標(biāo)記法標(biāo)記細(xì)胞微絲向標(biāo)記好微管的細(xì)胞中直接加入PhalloidinTRITC，室溫孵育15min，再用PBS洗3次，每次10min。最后向Petri皿中滴加90%甘油PBS，激光共聚焦顯微鏡掃描成像，物鏡用63倍油鏡，圖片標(biāo)尺長度為20μm。2結(jié)果2.1用4%甲醛固定法的H1299細(xì)胞骨架形態(tài)觀察用4%甲醛固定的H1299

9、細(xì)胞，進(jìn)行熒光標(biāo)記后，微管結(jié)構(gòu)隱約可見，層次不清晰，且細(xì)胞胞漿中非特異熒光較強(qiáng)，整個(gè)圖片的背景噪聲較高(圖1A）；微絲呈現(xiàn)清晰的束狀纖維，層次清晰，立體感較強(qiáng)(圖1B）；圖像疊加之后的兩種熒光有竄色現(xiàn)象，微管和微絲共定位不清晰，2種結(jié)構(gòu)較難區(qū)分清楚(圖1C）。架進(jìn)行很好地固定，導(dǎo)致觀察不到清晰的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，因而需要加入一些輔助試劑，如穩(wěn)定骨架結(jié)構(gòu)的試劑MES，使細(xì)胞骨架在細(xì)胞脫離培養(yǎng)環(huán)境的時(shí)候不易發(fā)生解聚，達(dá)到穩(wěn)定骨架以及固定作用。綜

10、上所述，不同固定劑的固定原理不同，對(duì)細(xì)胞成分、蛋白、結(jié)構(gòu)等的固定效果也有差異。在不同的實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的固定劑和輔助試劑，以達(dá)到最佳固定效果。參考文獻(xiàn)：[1]袁聿軍.細(xì)胞骨架的基本成分與功能[J].生物學(xué)教學(xué)200631(4):58.[2]周永紅陳利國屈援等.2型糖尿病患者血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞骨架及胞漿內(nèi)游離鈣的影響[J].中國老年學(xué)雜志200929(15):18651867.[3]曹小紅王愛華王春玲等.Surfacti

11、n對(duì)人乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞骨架的影響[J].生物工程學(xué)報(bào)200925(11):17051710.[4]江奇峰蔡紹皙晏小清.鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架穩(wěn)定性影響腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力[J].生物物理學(xué)報(bào)201026(2):125137.[5]劉繼紅蔡學(xué)泳何其華.細(xì)胞骨架的激光共焦研究技術(shù)[J].中國醫(yī)學(xué)裝備20052(6):4951.[6]徐營張慶華關(guān)娜等.應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡研究卵母細(xì)胞和早期胚胎的細(xì)胞骨架[J].細(xì)胞

12、生物學(xué)雜志200830:406410.[7]鄭君芳王瑛陳鵬等.EBP50影響HeLa細(xì)胞微絲骨架的分布和定位[J].中國腫瘤臨床200835(20):11921195.[8]蔡軍辛梅珍姜敘誠等.As2O3誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞骨架改變病理學(xué)觀察[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志200319(4):416419.[9]楊本艷姿王紅兵楊力等.MLCK和ROCK對(duì)細(xì)胞骨架和細(xì)胞行為的影響[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志200931(4):469475.[10