冷凍對(duì)小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育潛能及細(xì)胞骨架的影響.pdf

1、目的：通過(guò)比較不同冷凍方法(SOPS玻璃化冷凍和慢速冷凍)及卵丘細(xì)胞對(duì)小鼠卵母細(xì)胞冷凍復(fù)蘇、體外成熟、胚胎發(fā)育及細(xì)胞骨架的影響，以尋求最佳的卵子冷凍方法，為建立人類(lèi)卵子庫(kù)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：實(shí)驗(yàn)所用不同成熟階段的卵子(MII和GV)均來(lái)自體重為20～25克的昆明雌性小鼠。分別以SOPS玻璃化冷凍法(以乙二醇、二甲基亞砜及蔗糖為冷凍保護(hù)劑)及慢速冷凍法(以丙二醇和蔗糖為冷凍保護(hù)劑)冷凍保存，分析不同冷凍方法對(duì)不同成熟階段卵

2、子冷凍結(jié)果的影響，以確定最適合的冷凍保存方法，并以此為依據(jù)，選擇最終的卵子冷凍保存方法。確定冷凍方法后，以該冷凍方法分別冷凍保存有無(wú)卵丘細(xì)胞的卵子(COC及DO)及體外培養(yǎng)成熟之前或之后的GV卵。解凍復(fù)蘇后，MII卵經(jīng)體外培養(yǎng)1～2h，GV卵則經(jīng)體外培養(yǎng)成熟(IVM)后，分別作體外受精(IVF)、胚胎培養(yǎng)或固定作免疫熒光標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)復(fù)蘇率，成熟率、受精率、囊胚率等常規(guī)胚胎學(xué)指標(biāo)及紡錘體等細(xì)胞骨架指標(biāo)。最后，MⅡ卵在經(jīng)玻璃化冷凍或僅經(jīng)玻璃化

3、冷凍保護(hù)劑處理后體外孵化0h、1h和3h后，分析卵子細(xì)胞骨架指標(biāo)的變化趨勢(shì)。 結(jié)果： 第一部分： (一)不同冷凍方法對(duì)卵子的影響： 玻璃化冷凍MII卵和GV卵的復(fù)蘇率分別為86.49％和85.95％，均顯著高于慢速冷凍組(分別為40.38％和57.14％)(P<0.01)。玻璃化冷凍MII卵和GV卵的受精率與慢速冷凍相比均無(wú)顯著性差異(MⅡ：3L68％Vs.32.82％；GV：30.05％vs.28.21

4、％，P>0．05)。玻璃化冷凍MII卵和GV卵囊胚率均顯著高于慢速冷凍組(MⅡ：53.14％vs.31.25％，GV:52.5％vs.31.82％，P<0.05)。玻璃化冷凍和慢速冷凍GV卵分別獲得83.2％和80.56％的成熟率，和對(duì)照組及兩組之間相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。玻璃化冷凍MII卵的紡錘體和染色體二者均正常率高于慢速冷凍組(52.38％vs.30％)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。玻璃化冷凍GV卵的紡錘體、染色體

5、及紡錘體和染色體均正常率均高于慢速冷凍組(70.97％vs.63.6496，61.2996vs.36.3696及61.29％vs.36.36％)，但均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 (二)兩種冷凍方法對(duì)不同成熟階段卵子的影響： 玻璃化冷凍：MII卵的復(fù)蘇率、受精率及囊胚率和GV卵相比，均無(wú)顯著性差異(P>0．05)；GV卵紡錘體、染色體及紡錘體和染色體均正常率均高于MⅡ卵，分別為70.9796vs.57.14％、61.2

6、9％vs.57.1496及61.2996vs.52.3896，但均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。慢速冷凍：MII卵復(fù)蘇率顯著低于GV卵(40．38％vs．57．1496，P<0.01)，MII卵和GV卵的受精率、囊胚率及細(xì)胞骨架正常率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 綜合以上參數(shù)，確定玻璃化冷凍法更有利于卵子冷凍保存，并選擇為下階段卵子冷凍保存研究的最終方法。 第二部分：玻璃化冷凍對(duì)有無(wú)卵丘細(xì)胞卵子的影響 1．M

7、Ⅱ-COC和GV-COC玻璃化冷凍的復(fù)蘇率與各自DO的復(fù)蘇率相比，分別為86.49％vs60.92％，和85.9596vs64.9396，均有顯著性差異(P<0.01)。 2．玻璃化冷凍MⅡ-COC組和MⅡ-DO組的受精率和囊胚率均無(wú)顯著性差異，分別為31.68％vs.31.34％和53.1496vs.52.3896(P>0.05)，GV-COC組受精率和囊胚率均高于GV-DO組，分別為30.0596vs．24.6396和52.

8、5％Vs.42％，但均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。GV-COC組和GV-DO組的成熟率分別為83.20％和79.79％，兩組相比及與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 3．MⅡ-COC組的紡錘體、染色體及紡錘體和染色體均正常率均高于MⅡ-DO組，分別為57.1496vs.4496、57.14％vs.56％及52.3896vs.36％，但均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。MII-COC和MⅡ-DO兩組染色體正常率(57.1

9、40,06和56％)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。MⅡ-DO組紡錘體和染色體均正常率與對(duì)照組相比有顯著性差異(3696vs.7596，P<0.01)。GV-COC組、GV-DO組及對(duì)照組的紡錘體、染色體及紡錘體和染色體均正常率三組相比，均無(wú)顯著性差異(分別為70.97％vs.61.5496vs.70.83％、61.29％vs.61.54％vs.7596及61.29％vs.53.85％vs.62.5％，P>0.5)。 第三部分：

10、GV卵冷凍時(shí)機(jī)的選擇 1．GV冷凍組和IVM-MⅡ冷凍組復(fù)蘇率分別為65％和69.93％(P>0.05)。 2．GV冷凍組染色體、紡錘體及染色體和紡錘體均正常率均高于IVM-MII組(分別為61.54％vs.42.22％，61.54％vs.42.22％，P>0.05；53.85％vs．26.67％，P<0.05)。IVM-MII組紡錘體、染色體及紡錘體和染色體均正常率均顯著低于對(duì)照組，且均有顯著性差異(分別為42.22％

11、vs.70.83％，P<0.05；42.22％vs.75％，26.67％vs.62.5％，P<0.01)。 第四部分：玻璃化冷凍卵的細(xì)胞骨架修復(fù)能力及冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性分A組(對(duì)照組)、B組、C組和D組(分別為玻璃化凍融后體外培養(yǎng)0h、1h和3h)及E組、F組和G組(分別為經(jīng)玻璃化冷凍液處理后體外培養(yǎng)0h、1h和3h)共七組。 1.紡錘體正常率：B(50％)、C(66．67％)、E(52．38％)和F組(50％)均低于

12、A(75％)、D(80％)和G組(75％)，但各組之間相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 2．染色體正常率：B組顯著低于A組(50％vs.87.5％，P<0.01)，E組(47.62％)和F組(50％)顯著低于A組(87.5％)(P<0.01)和G組(75％)(P<0.05)。 3．紡錘體和染色體均正常率：B組顯著低于A組(4L67％vs．75％，P<0．05)，E組(47．62％)和F組(45％)顯著低于A組和G組(

13、75％)(P<0．05)。B組、C組和D組及E組、F組和G組的細(xì)胞骨架正常率依次提高，且玻璃化冷凍組(B組、C組和D組)和冷凍液暴露組(E組、F組和G組)相應(yīng)時(shí)段(Oh、1h及3h)比較(即B組與E組、C組與F組及D組與G組比較)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1.與慢速冷凍比較，玻璃化冷凍更有利于MII及GV卵復(fù)蘇和改善胚胎發(fā)育；與MⅡ卵比較，冷凍GV卵對(duì)細(xì)胞骨架損傷較?。簝煞N冷凍方法均不影響GV卵凍融后成熟