高糖對(duì)足細(xì)胞凋亡和細(xì)胞骨架的影響及其可能的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能異常在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用。糖尿病腎病中足細(xì)胞數(shù)量減少、足突融合消失。但是目前關(guān)于糖尿病中足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白纖維骨架是否有改變以及是否與α-actinin-4、vinculin等肌動(dòng)蛋白纖維骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)和分布異常有關(guān)等尚不明確。本研究旨在觀察高糖對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞活性、細(xì)胞骨架及骨架相關(guān)蛋白的影響，并探討高糖導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。
　　方法：完全分化的小鼠條件永恒足細(xì)胞系誘

2、導(dǎo)分化后隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control）、甘露醇組（Mannitol）和高糖組（High glucose）。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)足細(xì)胞的活性；AnnexinV/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)肌動(dòng)蛋白纖維骨架（F-actin）、黏著斑蛋白（vinculin）及α-actinin-4的分布變化；Western Blotting檢測(cè)vinculin及α-actinin-4、mTOR、p-mTOR、AKT、pAKT

3、-T308、pAKT-S473、S6K、pS6K等蛋白水平的變化；觀察Akt/mTOR信號(hào)通路與足細(xì)胞活性和細(xì)胞骨架改變的相關(guān)性。
　　結(jié)果：高糖刺激24小時(shí)后足細(xì)胞活性下降顯著高于正常對(duì)照組和甘露醇組，三組足細(xì)胞活性分別下降了16％(1.00±0.01 vs0.84±0.16)、4%（1.00±0.00 vs0.96±0.01）和1%（1.00±0.01vs0.99±0.06），高糖刺激24小時(shí)與對(duì)照組和甘露醇組比較差異均具有統(tǒng)

4、計(jì)學(xué)意義(p均<0.05)。高糖刺激24、48小時(shí)后凋亡的足細(xì)胞數(shù)量顯著增加，高糖刺激24小時(shí)、48小時(shí)后凋亡足細(xì)胞數(shù)量分別是對(duì)照組的1.73±0.17倍（p<0.001）和2.05±0.20倍（p<0.001），并且隨著高糖刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡足細(xì)胞數(shù)也顯著增加（p<0.05）。同時(shí)Western Blotting結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，高糖組足細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase3蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（1.81±0.18 vs1

5、.00±0.01，p<0.05），而甘露醇組與正常對(duì)照組相比，足細(xì)胞cleaved caspase3蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.08±0.17 vs1.00±0.01）。
　　免疫熒光染色顯示，正常足細(xì)胞內(nèi)F-actin以張力纖維絲的形式沿細(xì)胞的長(zhǎng)軸平行排列；高糖刺激14天后足細(xì)胞內(nèi)的F-actin張力纖維絲顯著減少；而甘露醇組足細(xì)胞F-actin張力纖維絲與正常對(duì)照組無(wú)明顯差別。對(duì)照組足細(xì)胞內(nèi)α-actinin-4主要分布

6、在細(xì)胞周邊，肌動(dòng)蛋白微絲以及細(xì)胞膜皺褶中；高糖刺激7天后足細(xì)胞內(nèi)α-actinin-4分布向細(xì)胞核附近集中；而甘露醇組足細(xì)胞內(nèi)α-actinin-4的分布與對(duì)照組相似。高糖刺激7天后，足細(xì)胞vinculin的表達(dá)未見(jiàn)顯著改變，在各組中均呈點(diǎn)狀分布。Western Blotting顯示，高糖刺激7天后α-actinin-4的蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下調(diào)，表達(dá)量下調(diào)50%左右（1.00±0.00 vs0.45±0.19，P<0.001）；而

7、甘露醇組與正常對(duì)照組α-actinin-4的蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（1.00±0.00 vs0.90±0.10，P>0.05）。各組 vinculin蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異（正常組，甘露醇和高糖組分別為1.00±0.00，1.11±0.33，1.18±0.22，兩組間比較P均>0.05）。
　　高糖刺激24小時(shí)后觀察足細(xì)胞Akt/mTOR通路蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖組 pAKT-S473磷酸化水平較正常對(duì)照組明顯下降（1.00±0.

8、00 vs0.28±0.07，p<0.05），pAKT-T308位點(diǎn)磷酸化水平也明顯下降（1.00±0.00 vs0.52±0.04，p<0.05）。而甘露醇組 AKT的這兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.00± vs1.05±0.01，p>0.05；1.00±0.00 vs0.93±0.02，p>0.05）。高糖組足細(xì)胞磷酸化 mTOR水平與對(duì)照組相比顯著降低（1.00±0.00 vs0.50±0.11，p<0.05

9、），而甘露醇組足細(xì)胞表達(dá)則無(wú)顯著改變(1.00±0.00 vs0.93±0.08，p>0.05)。高糖組足細(xì)胞S6K磷酸化水平也明顯下降（0.82±0.01 vs0.46±0.07，p<0.05）。甘露醇組與正常對(duì)照組相比結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.82±0.01 vs0.77±0.05)。
　　結(jié)論：高糖可以誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，使足細(xì)胞活性下降，凋亡增加，足細(xì)胞F-actin骨架重排，α-actinin-4的分布改變，表達(dá)下降。高糖誘導(dǎo)的