機械力對骶韌帶成纖維細胞骨架的影響.pdf

1、目的:
　　 1、探究機械力在盆底功能障礙性疾病發(fā)病中的作用。
　　 2、研究機械力對盆底骶韌帶成纖維細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及細胞骨架的影響。
　　 3、探討細胞骨架形態(tài)功能的改變在盆底功能障礙性疾病發(fā)病中的貢獻。
　　 方法:
　　 1、研究對象:選取2011年10月-2012年9月在河北醫(yī)大二院因非POP（惡性腫瘤除外）行子宮全切除術(shù)患者的骶韌帶組織20例作為研究者，平均年齡49.8±4.36歲，產(chǎn)次2

2、.56±1.07次，體重指數(shù)25.01±2.89kg/m2。所有入選患者均無結(jié)締組織疾病，術(shù)后病理證實為非子宮內(nèi)膜異位癥、非卵巢內(nèi)分泌腫瘤等雌激素相關(guān)疾病，去除急慢性盆腔炎和盆腔炎后遺癥的患者，去除有該部位手術(shù)史者及近期有雌激素用藥史者。
　　 2、取材:經(jīng)河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院倫理委員會同意，所有入選患者簽署知情同意書。所取標本為子宮骶韌帶近宮頸部分，筋膜外子宮全切時切取約5mm左右的骶韌帶組織，4℃冰盒送實驗室，整個取材運輸過

3、程要求嚴格無菌且小于2h。
　　 3、成纖維細胞的原代培養(yǎng)和鑒定:采用組織塊法和膠原酶消化法進行骶韌帶成纖維細胞的原代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下進行細胞形態(tài)學觀察并記錄生長曲線，免疫細胞化學染色進行細胞鑒定。
　　 4、細胞力學實驗:選取20例3～4代指數(shù)生長期的骶韌帶成纖維細胞，利用Flexcercell4000柔性基底加載系統(tǒng)加載，加力，加載過程在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進行。細胞樣本培養(yǎng)于特制的一次性六孔BioFlex培養(yǎng)板上

4、，其材質(zhì)為可變形的硅膠柔性基底膜，其上包被有collagenⅠ。加載程序由Flexcercell4000計算機軟件自動控制。加載參數(shù):幅度12％和20％，正弦波，0.5Hz，加載時間分為0、4、12、24h，以靜態(tài)不加力0h為對照組，卸載后立即提取各加力時間組細胞骨架蛋白。激光共聚焦顯微鏡觀察加力前后成纖維細胞骨架形態(tài)(F-actin)，westernblot免疫印跡法測量加力前后成纖維細胞骨架蛋白表達量。
　　 結(jié)果:

5、　　 1、所培養(yǎng)細胞為成纖維細胞，光鏡下細胞以梭形為主，也可見到不規(guī)則三角形、多角形等各種形狀的細胞，并互相連接成網(wǎng)狀。免疫細胞化學染色中間絲波形蛋白(vimentin)陽性，細胞純度91.3％，平滑肌肌動蛋白(α-SMA)染色約9.3％陽性，角蛋白(cytokeratin)染色陰性。
　　 2、機械力作用后，細胞的外在形態(tài)發(fā)生變化。拉伸前細胞形態(tài)多樣，以梭形為主，也可見到多角形、不規(guī)則三角形等各種形狀的細胞，向周圍伸展，并互

6、相連接成網(wǎng)狀;12％機械力作用4h后，受力細胞及其細胞突起沿加力方向一致被拉長，隨加力時間的延長，細胞形態(tài)趨于一致，垂直于最大受力方向排列。20％的機械力作用4h后，受力細胞開始發(fā)生皺縮，細胞也開始脫落，隨加力時間的延長，細胞逐漸失去貼壁狀態(tài)，脫落明顯，趨于死亡。
　　 3、激光共聚焦顯微鏡染色結(jié)果:細胞胞質(zhì)中的微絲呈綠色熒光，加力前actin纖維粗且分布均勻，12％機械力作用后，形態(tài)不規(guī)則，沿力的方向排列整齊，actin纖維細

7、且分布不均勻，細胞actin熒光染色強度隨加力時間的延長而下降，加力12h后，actin熒光染色強度逐漸恢復到加力前形態(tài)，即細胞actin熒光染色強度由正常到下降再到正常。20％機械力作用后，細胞胞漿actin出現(xiàn)解聚消失現(xiàn)象，細胞actin熒光染色強度隨加力時間的延長而下降，加力12h后，actin熒光染色強度沒有恢復到加力前形態(tài)，而是逐漸減弱甚至消失。
　　 4、Western-Blot免疫印跡結(jié)果:加載幅度12％時，act

8、in微絲蛋白表達量4h(0.6128±0.0002)、12h(0.6128±0.0002)、24h(0.6129±0.0002)較未加力0h（0.6130±0.0001）無明顯變化，各組間差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05;α-tubulin微管蛋白表達量4h（0.5709±0.0002）、12h（0.5710±0.0002）、24h（0.5712±0.0002）較未加力0h(0.5712±0.0001)無明顯變化，各組間差異無統(tǒng)計學意義，

9、P＞0.1;β-tubulin微管蛋白表達量4h（0.5709±0.0001）、12h(0.5711±0.0001)、24h（0.5711±0.0001）較未加力0h（0.5712±0.0004）無明顯變化，各組間差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.1;vimentin中間纖維蛋白4h表達量（0.5880±0.0002）較未加力0h（0.8394±0.0002）下降，組間差異有統(tǒng)計學意義，P=0.000＜0.01，12h表達量(0.5995±0.

10、0001)較4h上升，組間差異有統(tǒng)計學意義，P=0.000＜0.01，24h表達量（0.7436±0.0001）較12h上升，組間差異有統(tǒng)計學意義，P=0.000＜0.01。加載幅度20％時，actin微絲蛋白表達量4h(0.5375±0.0001)、12h（0.3659±0.0002）、24h（0.2716±0.0000）較未加力0h（0.6131±0.0001）有明顯下降，各組間差異有統(tǒng)計學意義，P=0.000＜0.01;α-tub

11、ulin蛋白4h（0.5087±0.0003）、12h（0.3903±0.0002）、24h（0.1943±0.0002）表達量較未加力0h（0.5712±0.0001）有明顯下降，各組間差異有統(tǒng)計學意義，P=0.000＜0.01;β-tubulin微管蛋白表達量4h（0.5057±0.0001）、12h（0.3901±0.0001）、24h（0.1886±0.0003）較未加力0h(0.5712±0.0004)有明顯下降，各組間差異有

12、統(tǒng)計學意義，P=0.000＜0.01;vimentin中間纖維蛋白表達量4h(0.4616±0.0003)，12h(0.3120±0.0002)，24h（0.2716±0.0001）較未加力0h(0.8394±0.0002)有明顯下降，各組間差異有統(tǒng)計學意義，P=0.000＜0.01;
　　 結(jié)論:
　　 1、一定范圍的機械應力可以改變細胞的形態(tài)和伸展方向，導致細胞骨架的重排，并借助第二信使將力學信號傳遞并轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)基因