血管生成素對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、第一部分過氧化氫誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老模型的建立
　　目的:
　　在體外培養(yǎng)條件下,正常體細(xì)胞在經(jīng)過有限次數(shù)的增殖分裂后即進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的分裂停滯狀態(tài),這種由于在連續(xù)的細(xì)胞分裂中端粒逐漸縮短所引發(fā)的現(xiàn)象稱為細(xì)胞復(fù)制性衰老。除此以外,氧化應(yīng)激、某些癌基因過度表達(dá)、紫外線、化學(xué)誘變劑等應(yīng)激因素亦可誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入一種應(yīng)激性早衰狀態(tài)。細(xì)胞早衰不依賴端粒的縮短,并且與復(fù)制性衰老細(xì)胞在形態(tài)、功能及生物學(xué)特性上具有許多相同的特征。細(xì)胞衰老是生

2、物整體衰老的基礎(chǔ),以細(xì)胞為模型的衰老生物學(xué)研究是當(dāng)前老年醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容。H2O2是一種廣泛使用的致細(xì)胞早衰的誘導(dǎo)劑,通過DNA損傷機(jī)理誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,且外源性上調(diào)端粒酶的活性不能抑制其誘導(dǎo)衰老作用。因此本研究首先通過過氧化氫誘導(dǎo),探討可否在體外建立成功而穩(wěn)定的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(MGECs)衰老模型,從而為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定良好模型基礎(chǔ)。
　　方法:
　　應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞,選擇過氧化氫(H2O2)作為

3、誘導(dǎo)物。設(shè)立正常對照組、H2O2組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)方法檢測衰老細(xì)胞陽性率,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,Western blot免疫印跡法檢測p16蛋白的表達(dá),通過分析H2O2對細(xì)胞衰老指標(biāo)的影響鑒定其作用后是否可引起MGECs衰老。同時(shí)通過Hoechst-33342染色法及流式細(xì)胞術(shù)檢測H2O2對細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.H2O2(50μmol/L)誘導(dǎo)7天后,在倒置相差顯微鏡下觀

4、察可見腎小球內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞體積增大,胞體扁平,呈現(xiàn)衰老細(xì)胞形態(tài);
　　2.SA-β-Gal染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:正常細(xì)胞SA-β-Gal染色幾乎無陽性表達(dá)(0.76±0.24％),隨H2O2作用時(shí)間延長陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多;H2O2作用3天即可觀察到少量SA-β-Gal染色陽性衰老細(xì)胞(13.12±1.81％)的出現(xiàn),繼續(xù)予以H2O2作用7天后SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞可達(dá)70.47％;
　　3.對細(xì)胞周期的分析

5、發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,H2O2具有阻止腎小球內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入增殖期(S期),而將細(xì)胞周期阻滯于靜止期(G1期)的作用,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　4.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對照組相比H2O2組p16蛋白的表達(dá)顯著增高(Control:21.09±0.67vs.H2O2:69.39±4.10),差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　5.hoechest-33342著染后H2O2組并未出現(xiàn)明

6、顯凋亡樣細(xì)胞改變,同樣流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示正常對照組及H2O2組細(xì)胞G1峰前均無凋亡峰出現(xiàn),細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(3.19±0.49％vs3.26±0.39％,P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　過氧化氫在體外能成功誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老。H2O2(50μmol/L)誘導(dǎo)7天后衰老相關(guān)SA-β-Gal染色陽性,細(xì)胞周期阻滯于G1期,p16蛋自表達(dá)上調(diào)。且H2O2作用后細(xì)胞無異常凋亡發(fā)生。過氧化氫誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老的模型成功

7、、可信。
　　第二部分血管生成素對過氧化氫誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用研究
　　目的:
　　衰老是一個(gè)自然進(jìn)程,在所有物種中都有此現(xiàn)象,并導(dǎo)致很多器官出現(xiàn)退行性改變。腎臟是受衰老影響最明顯的器官之一,腎臟功能隨衰老進(jìn)程逐漸減退。腎臟衰老時(shí)存在血管形成異常,表現(xiàn)為局灶性腎小管周圍及腎小球毛細(xì)血管密度減少;隨著年齡的增長,腎小球出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行性減少和丟失。但目前有關(guān)腎臟毛細(xì)血管改變與衰老相關(guān)腎臟病變的直接關(guān)系尚未明了。

8、血管生成素(Ang)是一組內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長因子,可以有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、介導(dǎo)新生血管管腔形成。Angl可促使Tie2磷酸化,提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活能力,促進(jìn)血管生成,而Ang2則作用相反,能抑制Ang1介導(dǎo)的Tie2活化。本部分研究擬探討血管生成素系統(tǒng)是否能夠調(diào)控腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的衰老,進(jìn)而影響腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的功能及腎臟新生血管的生成,并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞,設(shè)立正常對

9、照組、H2O2組、Ang1組、Ang2組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)MGECs衰老,通過β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、Western blot檢測p16蛋白表達(dá)評估細(xì)胞衰老指標(biāo)的變化。應(yīng)用硝酸還原酶法檢測內(nèi)皮細(xì)胞NO的分泌量,ELISA方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞vWF的分泌量,Matrigel凝膠實(shí)驗(yàn)檢測內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力,探討血管生成素對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。比色法測定細(xì)胞裂解液中的丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(G

10、SH)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的水平。Western blot方法檢測Tie2、ERK2/2信號通路的變化。
　　結(jié)果:
　　1.血管生成素對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老指標(biāo)的影響:H2O2組SA-β-Gal陽性率增高,Ang1作用后細(xì)胞SA-β-Gal著色變淺、陽性率降低,與H2O2組相比其陽性率下降達(dá)到51.80％(P＜0.05),而Ang2組和H2O2組之間SA-β-Gal陽性率無顯著性差異(P＞0.05

11、);H2O2誘導(dǎo)衰老后細(xì)胞周期阻滯于G1期,Ang1組G1期細(xì)胞比例下降至74.50±0.16％,S期細(xì)胞比例上升至18.89±0.68％,與H2O2組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但Ang2組G1期及S期細(xì)胞數(shù)與H2O2組無明顯差異(P＞0.05);H2O2組p16蛋白表達(dá)增高,Ang1作用后p16表達(dá)水平較H202組下降44.30％(P＜0.05),但Ang2對p16蛋白表達(dá)無影響(P＞0.05)。
　　2.血管生成素

12、對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響:H2O2組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌量明顯減少,Ang1組細(xì)胞NO分泌顯著增加(H2O2:10.26±0.69vs.Ang1:15.61±1.61,P＜0.05),Ang2組NO分泌量與H2O2組無明顯差異(Ang2:10.15±0.42,P＞0.05);H2O2組vWF含量明顯升高(P＜0.05),Ang1作用后vWF含量顯著降低(Ang1:5.13±0.69vsH2O2:9.88±0.27,P＜0.05),而

13、Ang2對vWF分泌無明顯影響(Ang2:10.02±0.31,P＞0.05);H2O2組MGECs管狀結(jié)構(gòu)形成能力顯著抑制,Ang1組細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成明顯增加(P＜0.05),而Ang2組則與衰老組無明顯差異。
　　3.血管生成素對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響:H2O2組MDA含量增加,與H2O2組相比,Ang1組MDA含量降低(H2O2;10.31±0.22vs.Angl;5.02±0.47,P＜0.05),而Ang2組M

14、DA含量則無顯著變化(Ang2;9.13±0.81,P＞0.05);與正常對照組相比,H2O2組GSH、SOD、CAT活性均明顯降低,與H2O2組相比,Ang1作用后GSH、SOD、CAT活性均顯著升高(P＜0.05),但Ang2組GSH、SOD、CAT活性則無顯著性差異。
　　4.血管生成素對Tie2-ERK1/2通路的影響:Westen blot結(jié)果顯示Ang1組P-Tie2水平明顯增高(H2O2:4.12±2.06vs.An

15、g1:71.09±2.15,P＜0.05),Ang2組P-Tie2無明顯變化(Ang2:10.07±3.16,P＞0.05);Ang1能顯著提高細(xì)胞P-ERK1/2水平(P＜0.05),但Ang2作用未能引起P-ERK1/2的明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　Ang1對過氧化氫誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老有保護(hù)作用,可以有效減少細(xì)胞的衰老程度,保護(hù)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能,增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶活性,拮抗H2O2引起的細(xì)胞氧

16、化損傷。同時(shí),Ang1可以激活Tie2、ERK1/2的磷酸化進(jìn)程。然而Ang2對內(nèi)皮細(xì)胞無上述保護(hù)作用。
　　第三部分血管生成素1對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老保護(hù)作用的機(jī)制探討
　　目的:
　　Ang1能與Tie2受體結(jié)合并活化Tie2受體,誘導(dǎo)磷酸化的ERK1/2表達(dá)升高,進(jìn)一步發(fā)揮其對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、粘附等的作用。在第二部分的研究中,我們的研究結(jié)果也提示Angl的確可以啟動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞Tie2及ERK1/2的磷酸化過程。Ang

17、l對H2O2所誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老的保護(hù)作用是否是通過激活Tie2-ERK1/2信號通路所致?為了更進(jìn)一步探討Ang1對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老保護(hù)作用的機(jī)制,我們用Ang1的天然拮抗劑.Ang2、Tie2受體的特異性抑制劑sTie2-Fc及MAPK信號通路MEK特異性抑制劑PD98059預(yù)處理腎小球內(nèi)皮細(xì)胞,以明確Ang1對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老的保護(hù)作用的信號通路。
　　方法:
　　應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞

18、,設(shè)立正常對照組、H2O2組、Ang1組、Ang2+Ang1組、sTie2-Fc組、PD98059組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)MGECs衰老,通過β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、Western blot檢測p16蛋白表達(dá)評估細(xì)胞衰老指標(biāo)的變化。應(yīng)用硝酸還原酶法檢測內(nèi)皮細(xì)胞NO的分泌量,ELISA方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞vWF的分泌量,Matrigel凝膠實(shí)驗(yàn)檢測內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力,探討血管生成素對內(nèi)皮細(xì)胞功能的

19、影響。Western blot方法檢測Tie2、ERK1/2信號通路的變化。
　　結(jié)果:
　　1.Tie2-ERK1/2通路抑制劑對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞衰老指標(biāo)的影響:與Ang1組比較,Ang2+Angl組、sTie2-Fc組及PD98059組SA-β-Gal陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(Ang2:63.94±2.05,sTie2-Fc:72.56±1.51,PD98059.73.31±2.73vs.Ang1:18.67±2.73,P＜0.

20、05);Ang2、sTie2-Fc及PD98059作用后,細(xì)胞周期分布比例仍呈現(xiàn)衰老細(xì)胞特征,細(xì)胞周期被阻滯于G1期,S期細(xì)胞較少,與Ang1組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Ang2、sTie2-Fc及PD98059能阻斷Ang1對p16蛋白表達(dá)降低的作用(Ang2:58.39±2.02,sTie2-Fc:61.08±3.10,PD98059:62.19±3.72vs.Ang1:21.16±1.11,P＜0.05);
　

21、　2.Tie2-ERK1/2通路抑制劑對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響:Ang2、sTie2-Fc及PD98059可以下調(diào)Ang1對內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌的促進(jìn)作用(Ang2:11.92±0.44,sTie2-Fc:10.22±0.36,PD98059:10.87±0.66vs.Ang1:16.38±0.35,P＜0.05);與Ang1組相比,予以Ang2、sTie2-Fc及PD98059作用后細(xì)胞vWF分泌量顯著增加(P＜0.05);Ang2+A

22、ng1組、sTie2-Fc組及PD98059組細(xì)胞血管腔形成能力下降(Ang2:23.11±2.29,sTie2-Fc:15.21±3.31,PD98059:18.56±2.36vs.Ang1:57.66±3.17,P＜0.05);
　　3.Tie2-ERK1/2通路抑制劑對Tie2-ERK1/2通路的影響:Westenblot結(jié)果顯示Ang2及sTie2-Fc能顯著抑制Ang1引起的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞P-ERK1/2水平的提高(An