通絡(luò)益腎方對(duì)糖尿病腎病大鼠腎小球足細(xì)胞骨架重排影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察通絡(luò)益腎方對(duì)單側(cè)腎切除+腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）糖尿病腎?。―N）大鼠腎小球足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及骨架蛋白基因水平探討該方的腎臟保護(hù)作用。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：通絡(luò)益腎方對(duì) DN大鼠足細(xì)胞骨架重排的影響
　　SD大鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，尿糖、尿蛋白檢測(cè)陰性后，隨機(jī)抽取10只作為正常對(duì)照組（簡稱正常組），正常組行假手術(shù)，其余大鼠采用右腎切除+腹腔注射鏈脲佐菌素建立大鼠

2、 DN模型。將造模成功后的大鼠隨機(jī)分為3組：DN模型組（簡稱模型組）、纈沙坦治療組（簡稱西藥組）、通絡(luò)益腎方治療組（簡稱中藥組），每組10只。正常組、模型組分別給蒸餾水灌胃，西藥組予纈沙坦混懸液灌胃，中藥組予通絡(luò)益腎方煎液灌胃，治療共持續(xù)6周。6周末稱重、收集24h尿液，檢測(cè)血清 BUN、 SCR；摘取左腎稱重，HE染色光鏡下觀察腎臟病理變化；透射電鏡觀察腎小球足細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；免疫組化法檢測(cè)足細(xì)胞骨架蛋白α-actinin-4、sy

3、naptopodin、 F-actin表達(dá)的變化；RT-PCR檢測(cè) Nephrin、CD2AP、α-actinin-4、synaptopodin、F-actin mRNA表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二：通絡(luò)益腎方不同給藥時(shí)期對(duì)DN大鼠足細(xì)胞骨架重排的影響
　　造模方法同實(shí)驗(yàn)一。分組如下：正常對(duì)照組（簡稱正常組）、 DN模型組（簡稱模型組）、纈沙坦治療組（簡稱西藥組）、通絡(luò)益腎方早期給藥組（簡稱中藥早期組）、通絡(luò)益腎方6周給藥組（簡稱中期

4、給藥組）、通絡(luò)益腎方8周給藥組（簡稱晚期給藥組），分別給予相應(yīng)的干預(yù)。其中，中藥早期組在造模成功后即給予中藥灌胃，中藥中期和晚期組分別在造模成功后第6周、第8周開始中藥灌胃。在造模成功后第12周末處死，送檢各指標(biāo)，檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)一。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一:通絡(luò)益腎方對(duì) DN大鼠足細(xì)胞骨架重排的影響
　　1.一般情況：與模型組對(duì)比，中西藥各給藥組大鼠糖尿病多飲、多食、多尿、消瘦、精神狀態(tài)等癥狀均有所改善。
　　2

5、.各組大鼠空腹血糖、相對(duì)腎重結(jié)果比較：與正常組比較，模型組、西藥組、中藥組空腹血糖、相對(duì)腎重均明顯升高（P<0.01）。治療6周后，與模型組相比，西藥組空腹血糖無顯著性差異（ P>0.05），中藥組空腹血糖顯著下降（P<0.01）；中藥組及西藥組的腎臟肥大指數(shù)均明顯低于模型組（P<0.01）。與西藥組相比，中藥組的空腹血糖明顯下降（P<0.01），但相對(duì)腎重值無顯著性差異（P>0.05）。
　　3.各組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量、尿白

6、蛋白、血肌酐及尿素氮結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組、西藥組、中藥組24h尿蛋白量、尿白蛋白量、血肌酐和尿素氮均明顯升高（P<0.01）；給藥6周后，與模型組相比，中藥組、西藥組上述各指標(biāo)均明顯下降（ P<0.05，P<0.01）。與西藥組比較，中藥組尿素氮下降（P<0.01），但24h尿蛋白量、尿白蛋白含量、血肌酐無明顯差異（均 P>0.05）。
　　4.腎臟組織病理學(xué)及腎小球足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化：西藥組和中藥組腎小球體積肥大、基

7、底膜增厚、系膜增生及毛細(xì)血管腔狹窄程度均減輕；超微結(jié)構(gòu)見足突融合減輕，足細(xì)胞骨架纖維紊亂改善。中藥組和西藥組兩組間比較差異不明顯。
　　5.各組大鼠足細(xì)胞骨架蛋白α-actinin-4、synaptopodin、F-actin免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組、西藥組、中藥組α-actinin-4、synaptopodin、F-actin表達(dá)均下降，差異有顯著性（P<0.01，P<0.05）。治療6周后，與模型組相比，中藥

8、組及西藥組上述指標(biāo)均升高（P<0.01），中西藥組間比較無顯著性差異（P>0.05)。
　　6.大鼠足細(xì)胞骨架蛋白α-actinin-4、 synaptopodin、 F-actin及裂孔隔膜蛋白Nephrin、 CD2AP mRNA檢測(cè)結(jié)果比較：與正常組比較，模型組、中藥組、西藥組大鼠足細(xì)胞α-actinin-4、synaptopodin、F-actin、Nephrin、CD2AP mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P<0.01，P<

9、0.05）；與模型組比較，中、西藥組各個(gè)基因的表達(dá)水平均明顯升高（P<0.01，P<0.05）；中西藥兩組對(duì)上述足細(xì)胞骨架蛋白及隔膜蛋白的改善無顯著性差異（P>0.05）。
　?。ǘ┩ńj(luò)益腎方不同給藥時(shí)期對(duì) DN大鼠足細(xì)胞骨架重排的影響
　　1.一般情況：與模型組比較，各給藥組大鼠精神狀態(tài)、體重，多飲、多尿、多食等癥明顯改善，以中藥早期組和西藥組癥狀最輕、狀態(tài)最好，中藥中期組及中藥晚期組次之。
　　2.各組大鼠空腹血

10、糖、相對(duì)腎重結(jié)果比較：與正常組比較，模型組和各給藥組空腹血糖及相對(duì)腎重明顯升高（均 P<0.01）；與模型組比較，各中藥組空腹血糖、相對(duì)腎重明顯下降（P<0.01，P<0.05），西藥組空腹血糖無顯著性變化（P>0.05），但相對(duì)腎重下降（P<0.05）。與中藥早期組比較，中藥中期組血糖及相對(duì)腎重?zé)o顯著性差異（P>0.05），中藥晚期組相對(duì)腎重明顯升高（P<0.05），空腹血糖無顯著性差異（P>0.05）。
　　3.各組大鼠24小

11、時(shí)尿蛋白定量、尿白蛋白、血肌酐及尿素氮檢測(cè)結(jié)果比較：與模型組比較，西藥組、中藥早期組、中藥中期組的24小時(shí)尿蛋白定量、尿白蛋白、尿素氮、血肌酐明顯下降（均P<0.01）；中藥晚期組尿白蛋白、血肌酐明顯下降（P<0.01），24小時(shí)尿蛋白定量、尿素氮無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與西藥組比較，中藥早期組上述四個(gè)指標(biāo)無顯著性差異（P>0.05），中藥中期組血肌酐、尿素氮顯著升高（P<0.01, P<0.05），中藥晚期組上述各項(xiàng)指標(biāo)顯著升高

12、（P<0.01）。與中藥早期組比較，中藥中期和晚期組各檢測(cè)指標(biāo)均不同程度升高（P<0.01，P<0.05）。中藥晚期組24小時(shí)尿蛋白定量、血肌酐顯著高于中期組（P<0.05）。
　　4.腎臟組織病理學(xué)及腎小球足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化：西藥組及中藥各治療組腎小球肥大及基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生減輕，足細(xì)胞較為完整，足突排列相對(duì)整齊，足突融合現(xiàn)象緩解；中藥早期組優(yōu)于中藥中期組和中藥晚期組。
　　5.足細(xì)胞骨架蛋白α-actinin-4

13、、 synaptopodin、 F-actin免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：與模型組比較，西藥組、中藥早期組、中期組α-actintin-4、synaptopodin、F-actin表達(dá)均明顯升高（P<0.01，P<0.05），中藥晚期組無顯著性差異（P>0.05）。與西藥組相比，中藥早期組α-actintin-4和中藥中期組、晚期組三個(gè)蛋白的表達(dá)均明顯降低（P<0.01，P<0.05）。與中藥早期組比，中藥中期組 synaptopodin、F

14、-actin表達(dá)和中藥晚期組三個(gè)蛋白的表達(dá)均明顯降低（P<0.01)，中藥晚期組各蛋白表達(dá)均低于中藥中期組（P<0.01，P<0.05）。
　　6.足細(xì)胞骨架蛋白α-actinin-4、 synaptopodin、 F-actin及裂孔隔膜蛋白Nephrin、CD2AP mRNA檢測(cè)結(jié)果比較：與模型組比較，西藥組及中藥早期，中期組的各基因表達(dá)均升高（P<0.01，P<0.05），中藥晚期組 synaptopodin和F-actin

15、表達(dá)無顯著差異（P>0.05）。與西藥組比，中藥晚期組各蛋白 mRNA表達(dá)量均顯降低（P<0.01，P<0.05），中藥中期組 CD2AP、 F-actin和中藥早期組各蛋白基因表達(dá)量無顯著差異（ P>0.05）；與中藥早期組比較，中藥晚期組各基因表達(dá)均明顯下調(diào)（ P<0.05），中藥中期組除α-actinin-4下降外（P<0.05），其余各基因表達(dá)量無明顯差異（P>0.05）。中藥晚期組 F-actin較中期組下降（P<0.05），

16、余指標(biāo)無顯著性差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.通絡(luò)益腎方可改善 DN大鼠的一般癥狀，能降低血糖、24h尿蛋白及尿微量白蛋白、血肌酐、血尿素氮，減輕腎小球病理形態(tài)改變，改善足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　2.通絡(luò)益腎方能上調(diào) DN大鼠足細(xì)胞的骨架蛋白分子（α-actinin-4、synaptopodin、F-actin）、裂孔隔膜蛋白分子（Nephrin、CD2AP）mRNA的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其保護(hù)足細(xì)胞的作用，從而抑制