單增李斯特氏菌檢測詳解

1、進(jìn)出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測方法SN/T 0184.1-2005,,李斯特氏菌,樣品的存放與制備,冷凍樣品：應(yīng)于2℃～5℃解凍，且不超過18小時；若不能及時檢驗，應(yīng)置于－15℃保存。非冷凍的易腐樣品：盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應(yīng)置于4℃冰箱保存，在24h之內(nèi)檢驗。無菌取樣品25g(mL)放入滅菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋中加225mL FB1增菌液中，充分均質(zhì)。,增菌培養(yǎng),225mL FB1 30℃±1℃培養(yǎng)25h&

2、#177;1h，吸取1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二次增菌25h±1h。,VIDAS快速篩選（可選）,FB2增菌液進(jìn)行VIDAS快速篩選。篩選為陰性的結(jié)果可直接報告未檢出。篩選為陽性的結(jié)果繼續(xù)分離培養(yǎng)和鑒定。,分離培養(yǎng),取增菌液一環(huán)，劃線分離于選擇性培養(yǎng)基OXA、PALCAM上，35℃±1℃培養(yǎng)24h～48h。菌落形態(tài)：24h后菌落呈現(xiàn)黑色，直徑為1mm，在其周圍形成一個黑色環(huán)。培養(yǎng)

3、48h，菌落仍成黑色，直徑2mm～3mm，除在菌落周圍有一環(huán)外，在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)。挑取5個或更多的可疑菌落，接種于TSA-YE。,鑒定,藍(lán)色菌落檢驗 用45°斜射光照射TSA-YE平板，菌落呈現(xiàn)藍(lán)灰色到藍(lán)色。 （設(shè)標(biāo)準(zhǔn)菌株對照）,鑒定,典型運(yùn)動鏡檢 李斯特氏菌為短棒狀桿菌，可見輕微的旋轉(zhuǎn)翻滾。 （設(shè)標(biāo)準(zhǔn)菌株對照）注：壓片法或懸滴法

4、 暗光,鑒定,革蘭氏染色 短桿狀革蘭氏陽性反應(yīng)注：陳舊培養(yǎng)物多轉(zhuǎn)為陰性。,鑒定,過氧化氫酶試驗 挑取TSA-YE平板上的菌落于潔凈載玻片上，滴加1滴3％的過氧化氫溶液，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應(yīng)。,鑒定,溶血試驗 刺種7％羊血瓊脂平板，并刺種陽性對照菌（單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌）和陰性對照菌（英諾克李斯特氏菌），30℃培養(yǎng)24h～48h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 窄小的β溶血環(huán)

5、西爾李斯特氏菌 窄小的β溶血環(huán) 綿羊李斯特氏菌 大的β溶血環(huán) 其他 不溶血,鑒定,動力試驗穿刺SIM半固體培養(yǎng)基，于室溫（20℃～25℃）培養(yǎng)48h。李斯特氏菌有動力，呈典型的傘狀生長。,鑒定,硝酸鹽還原試驗接種于硝酸鹽肉湯，于35℃培養(yǎng)5d。李斯特氏菌為陰性。,鑒定,

6、MR－VP試驗接種于MR－VP肉湯中，于35℃培養(yǎng)48h。李斯特氏菌為陽性反應(yīng)。,鑒定,三糖鐵試驗接種于TSI，35℃培養(yǎng)5d。李斯特氏菌斜面和底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)硫化氫。,鑒定,尿素酶試驗 穿刺尿素瓊脂斜面，于35℃培養(yǎng)5d。 李斯特氏菌尿素酶試驗陰性。,鑒定,糖發(fā)酵試驗 接種0.5%葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發(fā)酵管內(nèi)，35℃培養(yǎng)24h～48h，陰性繼續(xù)培養(yǎng)到第5天。,李斯特氏菌菌種鑒別特征,鑒定,協(xié)

7、同溶血試驗（cAMP） 在羊血瓊脂平板上各劃一直線，使兩線平行，在平行線上分別接種金黃色葡萄球菌ATCC49444和馬紅球菌ATCC6939，在兩線之間垂直接種，與兩線相近但不相交，于35℃培養(yǎng)24h～48h后，觀察相交處溶血情況。,L. monocytogenes L. innocua L. ivanovii,窄的β溶血帶 不溶血寬的β溶血帶,CAMP (Staphylococ

8、cus aureus),Staphylococcus aureus,,,Listeria monocytogenes,鑒定,API鑒定試驗 可代替硝酸鹽還原、MR-VP、三糖鐵、糖發(fā)酵、尿素酶和CAMP等試驗。,鑒定,血清學(xué)檢驗 菌懸液于80℃水域中加熱1h，離心棄上清，剩余液與沉淀混勻制成菌懸液，進(jìn)行血清學(xué)玻片凝集試驗。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B，1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C，4D

9、，4E，7,質(zhì)量控制,每次檢驗均需用標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株和陰性菌株進(jìn)行質(zhì)量控制。 樣品制備的同時，在空白對照FB1增菌液中加入新鮮配制的每毫升含有10個～100個單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的稀釋液1mL和陰性培養(yǎng)物，按檢驗程序進(jìn)行同步檢驗。,報告結(jié)果,協(xié)同溶血試驗、血清學(xué)試驗可根據(jù)需要進(jìn)行，常規(guī)檢驗可不進(jìn)行這些試驗。報告陽性結(jié)果：檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。報告陰性結(jié)果：未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。,,新舊標(biāo)準(zhǔn)的主要不同,增菌培養(yǎng)基