鴨圓環(huán)病毒ORF3基因的序列分析及基因表達(dá).pdf

1、鴨圓環(huán)病毒(DuCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，可導(dǎo)致鴨的免疫抑制，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)造成危害。本研究通過DuCV ORF3的片段大小對(duì)DuCV進(jìn)行了基因型分類，并通過原核表達(dá)和真核表達(dá)對(duì)ORF3的功能進(jìn)行了研究。主要內(nèi)容如下：
　　 ⑴鴨圓環(huán)病毒ORF3基因克隆測序及序列分析。為了解DuCV不同分離株的ORF3基因變異情況以及分析它們的同源性，本研究從臨床病料中對(duì)DuCV的ORF3基因進(jìn)行了克隆測序，結(jié)果獲得了10株DuCV的ORF3基

2、因序列，并與GenBank登錄的45株DuCV的ORF3基因進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明所有DuCV的ORF3基因根據(jù)大小及同源性差異分為兩個(gè)基因型：基因1型和基因2型。同一基因型之間的核苷酸同源性為95.8％～100％，氨基酸同源性為88.6％～100％，而不同基因型之間的核苷酸同源性僅為87.8％～91.6％，氨基酸同源性僅為72.2％～81.0％。55個(gè)毒株中的36個(gè)屬于基因1型，ORF3基因大小為237bp，編碼78個(gè)氨基酸的蛋白；

3、19個(gè)毒株屬于基因2型，ORF3基因大小為297bp，編碼98個(gè)氨基酸的蛋白。本研究獲得的10株DuCV的ORF3基因9株屬于基因1型，1株屬于基因2型，說明當(dāng)前我國流行的DuCV主要為ORF3基因1型。
　　 ⑵鴨圓環(huán)病毒FJ0601株ORF3蛋白的原核表達(dá)及其抗血清制備。本研究采用PCR方法擴(kuò)增出DuCV FJ0601株ORF3基因，將其克隆入原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，構(gòu)建了DuCV ORF3基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pE

4、T-32a-ORF3，將其轉(zhuǎn)入宿主菌Rosetta(DE3)Plys中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明DuCV ORF3蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，Western-blotting檢測結(jié)果顯示，該蛋白作為抗原可以與DuCV的陽性血清發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，從而首次證實(shí)了DuCV的ORF3為功能性基因，在DuCV感染宿主過程中進(jìn)行了表達(dá)。將原核表達(dá)的蛋白純化后免疫小鼠，制備了抗DuCV ORF3蛋白的血清，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。<

5、br>　　 ⑶DuCV ORF3基因的真核表達(dá)。采用PCR方法擴(kuò)增出DuCV FJ0601株的ORF3完整基因，并將其克隆到Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHT B中，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFast-ORF3，再將其轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，發(fā)生轉(zhuǎn)座作用，通過藍(lán)白斑篩選獲得含有ORF3基因的重組桿狀病毒DNA，以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒Bacmid-OR