廣西豬JEV FC792分離株全基因序列的測定與分析及RT-LAMP的建立與E基因抗原域的原核表達(dá).pdf

1、流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)是由乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種十分重要的人畜共患的急性傳染病，其主要流行于亞洲的東部和東南部以及澳大利亞等地區(qū)，其引起的死亡率可達(dá)20％以上。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，乙腦年發(fā)病人數(shù)已達(dá)35000例，其中中國的發(fā)病人數(shù)占到了80％。JEV可感染豬，引起妊娠母豬流產(chǎn)、公豬睪丸腫大和仔豬神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨

2、大的損失。豬是JEV主要的儲(chǔ)存和擴(kuò)散宿主，因此對豬感染乙腦的診斷與防制具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。
　　 首先，本研究以JEV SA14為模板設(shè)計(jì)JEV特異性引物，分7段擴(kuò)增JEV廣西分離株FC792全基因，經(jīng)序列測定與拼接后得到FC792分離株全基因組序列。FC792株全長10977個(gè)核苷酸，其中5’非編碼區(qū)有95個(gè)核苷酸，3’非編碼區(qū)有586個(gè)核苷酸，開放閱讀框含10296個(gè)核苷酸，共編碼3432個(gè)氨基酸。核苷酸與氨基酸同源性

3、分析發(fā)現(xiàn)FC792株與國內(nèi)外JEV代表毒株的核苷酸同源性為84.6％-99.7％，氨基酸同源性為96.2％-99.4％。其中與SA14-14-2和YUNNAN0901株核苷酸同源性分別為99.7％和99.6％，氨基酸同源性分別為99.4％和99.2％。遺傳進(jìn)化分析表明FC792株屬于基因Ⅲ型，且與YUNNAN0901和SA14-14-2株的遺傳進(jìn)化關(guān)系最為接近。FC792株與YUNNAN0901株核苷酸的差異率僅為0.45％，氨基酸差異

4、率為0.76％，結(jié)構(gòu)蛋白含有5個(gè)氨基酸的差異。
　　 其次，本研究建立了JEV RT-LAMP檢測方法，并進(jìn)行了反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，靈敏度實(shí)驗(yàn)表明本研究建立的JEV RT-LAMP檢測方法的檢測極限為0.5pg，特異性實(shí)驗(yàn)證明其具有較高的特異性。與RT-Nested-PCR比較，兩種方法檢出率的符合率為90.9％。而且反應(yīng)結(jié)束后可以通過添加化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行可視化觀察，大大縮短了檢測時(shí)間。
　　 第三，克隆出JEV F

5、C792株包含E基因抗原域Ⅰ和抗原域Ⅱ的基因片段Ea，成功構(gòu)建出原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Ea。用JEV陽性豬血清作為一抗進(jìn)行Western-blot分析，初步表明重組蛋白Ea具有抗原性，純化復(fù)性重組蛋白Ea，免疫小鼠2次，間隔1周，二免一周后眼球采血、分離血清，經(jīng)包被JEV全病毒的ELISA試劑盒檢測為陽性，說明Ea具有抗原性；ELSIA檢測為陽性的小鼠血清進(jìn)行病毒的中和試驗(yàn)，結(jié)果表明免疫組小鼠血清具有中和JEV的能力，中和抗體效價(jià)