ADV分離株全基因序列測(cè)定及VP2抗原表位區(qū)的表達(dá)與應(yīng)用.pdf

1、水貂阿留申病(Aleutian Disease，AD)是由細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)阿留申水貂病毒屬(Amdovirus)水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus，ADV)引起的免疫系統(tǒng)病理性失調(diào)，是一種主要侵染水貂、病程緩慢的傳染性疾病。該病以垂直和水平傳播兩種形式在世界各國(guó)的貂群中廣泛流行，導(dǎo)致沒有抗體的新出生幼貂的急性間質(zhì)性肺炎甚至死亡，成年水貂的繁殖能力、皮張質(zhì)量、健康狀況下降以及死亡

2、率增加，對(duì)水貂養(yǎng)殖業(yè)造成不可低估的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，我國(guó)水貂養(yǎng)殖區(qū)阿留申病的流行情況在國(guó)內(nèi)時(shí)有報(bào)道，高水平的AD感染一直是嚴(yán)重影響我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)高效、健康發(fā)展的一個(gè)非常重要的因素之一。由于目前針對(duì)該病缺少有效的防治方法，普遍采用的是通過定期檢測(cè)，淘汰患病貂群，從而達(dá)到凈化種群的目的。因此，在國(guó)內(nèi)進(jìn)行分離鑒定病毒株及進(jìn)行分子生物學(xué)特性研究，建立國(guó)內(nèi)適用的血清學(xué)診斷方法，將會(huì)對(duì)今后國(guó)內(nèi)開展水貂阿留申病的臨床診斷、有效防制及進(jìn)一步的深入研究，

3、提供更多的科學(xué)依據(jù)。 在本研究中，首先通過CIEP以及本實(shí)驗(yàn)室建立的ADV PCR檢測(cè)方法，對(duì)黑龍江某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病送檢貂以及遼寧某水貂養(yǎng)殖區(qū)疑似阿留申病貂進(jìn)行檢測(cè)，將經(jīng)兩種方法檢測(cè)均為陽性結(jié)果的毒株進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定，從中抽取序列較為保守的四株病毒與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照毒株進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析，與ADV-G相應(yīng)片段的核酸同源率分別為92.8％、93.9％、93.2％和93.5％，與參考株ADV-Utah的同源率分別為94.5

4、％、98％、94.6％和95.5％，確定為ADV特異性核苷酸片段。依據(jù)鑒定的結(jié)果，成功鑒定了四株病毒，分別命名為MS-1、DL-1、DL-2和DL-3。 將MS-1、DL-1、DL-2和DL-3株病毒經(jīng)組織病料提取總DNA，采用依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)毒株ADV-G的DNA序列設(shè)計(jì)并合成的四對(duì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后分別構(gòu)建重組質(zhì)粒并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用DNA Star軟件中的SeqMan程序進(jìn)行拼接，獲得四株病毒的近全長(zhǎng)DNA序列。用DNA Sta

5、r軟件MegAlign程序中的Jotun Hein method將實(shí)驗(yàn)測(cè)得的毒株與國(guó)外病毒參考株的對(duì)應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明，ADV-Utah與四個(gè)實(shí)驗(yàn)毒株的序列同源性較高，同源率為92.9-93.4％，ADV-G、ADV-SL3與實(shí)驗(yàn)毒株的同源性較低；四個(gè)實(shí)驗(yàn)毒株和三個(gè)參考毒株被分別劃歸為兩個(gè)組，分屬于兩個(gè)進(jìn)化分支；實(shí)驗(yàn)毒株中ADV-DL1與DL2和DL3雖然同為大連分離株，卻表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。用DNA S

6、tar軟件MegAlign程序中的Clustal W method將實(shí)驗(yàn)測(cè)得的ADV毒株核苷酸序列、ADV參考株序列以及細(xì)小病毒其它四個(gè)屬的代表毒株全序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)14株病毒共劃歸為五個(gè)相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化分支，ADV與牛犬細(xì)小病毒作為細(xì)小病毒亞科中新增的屬，與其它屬的成員分屬于不同的進(jìn)化分支，分析結(jié)果驗(yàn)證了ICTV8公布的新分類體系的合理性。 選擇VP2蛋白主要抗原表位區(qū)相對(duì)保守的ADV MS-1毒株作為種毒，分別設(shè)計(jì)合成

7、兩對(duì)引物，用PCR方法擴(kuò)增其VP2基因中主要抗原表位區(qū)的兩個(gè)片段，分別將其克隆到原核表達(dá)載體pMAL-c2的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-VP2a和pMAL-VP2b，經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切和測(cè)序分析確證其正確插入到表達(dá)載體中，閱讀框正確，成功地構(gòu)建了原核表達(dá)載體。陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌TB1，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)和免疫印跡分析。結(jié)果表明兩段融合蛋白均以包涵體形式獲得了有效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分別占

8、總菌體蛋白的32.7％和37.41％；表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量分別約為63kD和65kD，與理論推測(cè)的分子質(zhì)量一致；在終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)下，4h時(shí)其表達(dá)量達(dá)到高峰；Westem blot分析表明表達(dá)蛋白能被兔抗MBP抗體所識(shí)別。將分離和初步純化的表達(dá)包涵體蛋白作為抗原，對(duì)陽性血清進(jìn)行CIEP檢測(cè)，驗(yàn)證其免疫活性，并與標(biāo)準(zhǔn)抗原的CIEP檢測(cè)結(jié)果相比較，二者的符合率達(dá)到94.3％。以本實(shí)驗(yàn)獲得的重組蛋白作為診斷抗原的特異性、重復(fù)性、敏感