HBsAg和B19 VP2復合抗原的基因克隆及表達.pdf

1、背景與目的： 人微小病毒B19(HumanParvovirusB19)是微小病毒科微小病毒屬中目前已知的唯一使人類致病的病毒，也是動物病毒中體積最小結構最簡單的DNA病毒。主要經(jīng)呼吸道和血液途徑傳播，可引起社區(qū)局部流行。自1990年首次證實我國存在該病毒后，陸續(xù)報告B19病毒感染是我國孕婦非免疫性流產(chǎn)、兒童急性再障危象、急性血小板減少性紫癜等疾病的重要病因之一?，F(xiàn)己證實該病毒同多種兒童及成人疾病有關。同時，我國婦女和兒童血清中保

2、護性抗體水平低，易發(fā)生該病毒感染。尤其免疫功能低下或缺陷患者可發(fā)生持續(xù)感染和慢性貧血，危及生命。且隨著檢測手段的改進及研究的深入，其疾病譜還在不斷擴大。B19病毒基因組長約5．6kb，編碼兩個結構蛋白(VPl和VP2)及一個主要的非結構蛋白(NSl)。B19病毒衣殼蛋白主要由VP2蛋白組成，VPl蛋白不超過衣殼蛋白的10％，其獨特區(qū)暴露在病毒的表面。B19病毒感染引起的機體免疫反應主要是針對其結構蛋白VPl和VP2，而VPl除在其氨基端

3、有一227個氨基酸的獨特區(qū)外，其余與VP2相同。乙型肝炎病毒(HBV)的感染在人群中比例很高，且感染后體內能形成的主要保護性抗體為針對表面抗原(HBsAg)的表面抗體(抗一HBs)。本課題的目的是選擇B19一VP2抗原基因和HBsAg基因重組，利用pGEX一5X-1原核表達載體表達，從而建立表達B19和HBV復合抗原系統(tǒng)，并檢測此復合抗原的抗原性，給HBV和B19病毒重組多價疫苗的研制和復合診斷試劑提供抗原。 方法： 根

4、據(jù)GenBank收錄的HBV及B19病毒序列，設計PCR引物，并在每條引物前分別加入一定的內切酶位點。利用PCR和分子克隆技術，從含HBV病毒全基因的重組質粒pUCl8一HBV和含B19病毒全基因的重組質粒pGEMl一B19分別擴增出乙肝表面抗原(HBsAg)基因及B19病毒VP2基因；將其分別與pGEM-T載體連接，轉化入JMl09大腸桿菌中，利用氨芐青霉素抗性、藍白篩選篩選出陽性克隆，并以PCR等方法對陽性菌進行鑒定，從而構建出pG

5、EM-T-HBs及pGEM-T—VP2并測序分析；測序證實序列正確后，將pGEM-T-HBs中的HBs基因與pGEX-5X一1表達載體連接，并轉化入JMl09大腸桿菌，利用PCR方法鑒定得到pGEX-5X-i-HBs；再將pGEM—T-VP2中的VP2基因連接入pGEX一5X-1-HBs中，并轉化至BL21(DE3)宿主菌中，用PCR擴增等方法篩選出陽性克隆pGEX-5X-1-HBs—VP2并測序：以IPTG誘導含pGEX一5X一卜HB

6、s-VP2的宿主菌表達融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白表達情況，并用Western-blot鑒定融合蛋白的抗原性。 結果： 1．靶基因擴增：以含有B19病毒全基因的質粒為模板，利用PCR擴增得到VP2目的基因(3304-4968)，加上兩端內切酶位點共1680個堿基對；以含有HBV全基因的質粒為模板，利用PCR擴增得到HBsAg的目的基因(155—835)，加上兩端酶切位點共694個堿基對。 2．成功

7、構建pGEM-T-HBs及pGEM-T-VP2原核重組質粒，HBs及VP2基因的測序結果均與GenBank公布的一致。 3．成功構建pGEX一5X-1-HBs-VP2，并經(jīng)SDS—PAGE凝膠電泳分析結果表明，含pGEX一5X一卜HBs-VP2的BL21(DE3)宿主菌經(jīng)IPTG誘導后能表達出目的融合蛋白，分子量大小與預期的一致(111KD)。 4．Western—blot檢測結果顯示該融合蛋白均可與抗一HBs和抗一VP