傳染性法氏囊病病毒自然重配超強(qiáng)毒株的分離及其VP2和VP3基因的克隆表達(dá).pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)引起的以侵害雛雞淋巴組織尤其是中樞免疫器官—法氏囊為主要特征的一種急性、高度接觸性傳染病。該病主要侵害機(jī)體免疫器官，造成免疫抑制，致使疫苗免疫接種失敗。2004年以來，在華東地區(qū)商品代蛋雞場和肉雞場發(fā)生了多起IBD疫情，在流行病學(xué)與臨床癥狀方面表現(xiàn)為IBD疫苗免疫失敗、發(fā)病快

2、、死亡率高。本實(shí)驗(yàn)室從具有該流行病學(xué)特征的病雞法氏囊組織中分離到了兩株IBDV自然重配超強(qiáng)毒株，分別命名為QL和ZZ-11，并對其致病力特性、全基因組序列特征進(jìn)行了研究，最后對其主要結(jié)構(gòu)蛋白基因VP2和VP3進(jìn)行了克隆表達(dá)，并建立了IBDV抗體間接ELISA檢測方法。試驗(yàn)內(nèi)容包括:
　　實(shí)驗(yàn)一:傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒株的分離鑒定
　　從接種過IBDVB87疫苗的發(fā)病雞群中分離到兩株傳染性法氏囊病病毒(IBDV)，分別命名為

3、QL和ZZ-11。用該原始病雞法氏囊懸液連續(xù)3次人工感染SPF雞后，再取其法氏囊制備懸液，-70℃保存。經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚，測定雞胚的半數(shù)致死量(ELD50)。雞的日齡和接種劑量不同，其致死率有很大差異。對23-51日齡的SPF雞分別接種20、200、2000個(gè)ELD50劑量的QL株和ZZ-11株病毒后，1周內(nèi)死亡率均在55％以上，最高可達(dá)100％;對3～7周齡SPF雞致死率均較高，在90％左右;對13-15周齡的S

4、PF雞致死率也在50％左右。死亡雞法氏囊腫大出血，呈“紫葡萄”樣外觀，胸肌腿肌呈條帶狀出血，法氏囊/體重比較正常對照顯著下降。QL和ZZ-11株的VP2基因符合vvIBDV的氨基酸特征，包括222A、256I、279D、284A、294I、299S和位于326～332位七肽基序(SWSASGS)。致死率、病理變化、組織切片分析、VP2基因特征分析都說明QL和ZZ-11是超強(qiáng)毒株，并且具有致死率高、直接致死雞胚等特性。
　　實(shí)驗(yàn)二:

5、傳染性法氏囊病病毒自然重配株全基因組序列分析
　　從具有新的流行病學(xué)特征的傳染性法氏囊病(IBD)發(fā)病雞群中分離到兩株傳染性法氏囊病病毒(IBDV)，分別命名為QL和ZZ-11，對4周齡SPF雞的致死率分別為94％和86％。為分析該毒株的分子生物學(xué)特征，對其全基因組序列進(jìn)行了測定，兩個(gè)病毒株基因組A節(jié)段長度為3260bp、B節(jié)段長度2827bp。病毒演化分析結(jié)果顯示兩個(gè)病毒基因組A節(jié)段的核苷酸序列與已發(fā)表的超強(qiáng)毒株核苷酸序列的同源

6、性為96.8％～98.1％和96.9％～98.4％，處在IBDV超強(qiáng)毒株分支上;而B節(jié)段與已發(fā)表的弱毒株序列的同源性分別為89.7％～90.4％和90.0％～90.7％，位于弱毒株分支上。IBDV超強(qiáng)毒株和弱毒株序列特征氨基酸殘基與基序分析表明，QL和ZZ-11兩個(gè)病毒株的A節(jié)段VP2基因的氨基酸殘基為222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S，七肽基序?yàn)镾WSASGS，均符合超強(qiáng)毒株的分子特征;而B節(jié)段777

7、-782位核苷酸序列為GGTGCC，沒有KpnI酶切位點(diǎn)，具有弱毒株的序列特點(diǎn)。以上分析結(jié)果表明，QL和ZZ-11為IBDV自然重配株，A節(jié)段源于超強(qiáng)毒株，而B節(jié)段源于弱毒株。
　　實(shí)驗(yàn)三:傳染性法氏囊病病毒自然重配超強(qiáng)毒株VP2和VP3基因的克隆表達(dá)
　　從IBDV自然重配超強(qiáng)毒株QL株的法氏囊組織中擴(kuò)增出VP2和VP3結(jié)構(gòu)蛋白基因，VP2具有vvIBDV所特有的222A、253Q、256I、279D、284A、294I、

8、299S和位于326～332位的七肽基序SWSASGS，并具有其它超強(qiáng)毒株和弱毒株都沒有的127A、324R和370S氨基酸殘基;VP3基因與其它超強(qiáng)毒株和弱毒株的核苷酸與氨基酸同源性都很高，均在97.3％以上，但也有799A、849G、931V、976D四個(gè)特異的氨基酸殘基。將該VP2和VP3基因分別定向克隆入原核表達(dá)載體pET32a中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-VP2和pET32a-VP3，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)

9、;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后用SDS-PAGE分析，重組VP2融合蛋白的分子質(zhì)量為67kDa，表達(dá)量約占菌體總蛋白量的30％，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在于菌體中;重組VP3融合蛋白的分子質(zhì)量為57kDa，表達(dá)量約占菌體總蛋白量的40％，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在于菌體中;用Westernblot分析，重組VP2蛋白和重組VP3蛋白均與IBDV陽性血清發(fā)生特異性的反應(yīng);以純化的重組VP2蛋白和重組VP3蛋白為抗原建立的IBDV抗體間接ELISA