傳染性法氏囊病病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2和VP3調(diào)控細(xì)胞自噬的分子機(jī)制研究.pdf

1、自噬是一種細(xì)胞內(nèi)保守的蛋白及廢物降解機(jī)制，同時(shí)也在細(xì)胞清除病原的過程中發(fā)揮重要作用。在不同病毒的感染過程中，自噬扮演了不同的角色。至今未見IBDV與自噬關(guān)系的研究。本研究中，我們以DF-1細(xì)胞為模型研究了IBDV與細(xì)胞自噬的關(guān)系。為了解IBDV感染DF-1細(xì)胞后自噬的變化情況，檢測了IBDV感染細(xì)胞后內(nèi)源性LC3以及GFP-LC3的變化情況。
　　IBDV感染DF-1和293T細(xì)胞后，LC3-Ⅱ在0-2小時(shí)表現(xiàn)為顯著的上調(diào)，而在4

2、-6小時(shí)下降。同樣的， IBDV感染GFP-LC3轉(zhuǎn)化的DF-1和293T細(xì)胞中，GFP-LC3在2小時(shí)呈現(xiàn)大量的點(diǎn)狀分布，而在感染后4小時(shí)這些點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)消失。P62在IBDV感染過程中出現(xiàn)了同步變化。這些數(shù)據(jù)證明在病毒感染早期DF-1和293T細(xì)胞的自噬被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在病毒感染4小時(shí)后，自噬水平被抑制。綜上所述，IBDV感染在早期誘導(dǎo)了細(xì)胞的自噬，而后抑制了細(xì)胞自噬。
　　何種因素導(dǎo)致了細(xì)胞在感染2小時(shí)內(nèi)發(fā)生了自噬，為了解釋這一現(xiàn)象

3、，我們對病毒編碼的蛋白影響自噬的情況進(jìn)行了分析，證明僅VP2蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。然而VP2蛋白通過何種途徑誘導(dǎo)自噬？在研究中，我們發(fā)現(xiàn)病毒蛋白VP2能夠抑制mTOR和AKT的活性。因此，推測VP2蛋白通過細(xì)胞表面某一受體連接mTOR/AKT通路，并誘導(dǎo)自噬。實(shí)驗(yàn)證明，受體蛋白Hsp90能夠與IBDV VP2互作，并減弱Hsp90與AKT的互作，導(dǎo)致AKT和Hsp90的解聚，而抑制了AKT和mTOR的活性，這些數(shù)據(jù)證明I BDV通過其外殼蛋

4、白VP2與宿主細(xì)胞蛋白Hsp90的互作并因此抑制AKT/mTOR信號途徑活性而激活了自噬。
　　為了進(jìn)一步揭示IBDV感染細(xì)胞后，在激活自噬后又抑制自噬的現(xiàn)象，我們對自噬途徑做了進(jìn)行了進(jìn)一步分析，證明IBDV VP3通過其CC1結(jié)構(gòu)域與Beclin-1互作，并把Beclin-1從VPS34復(fù)合體中分離下來，從而抑制PI3P的形成。同時(shí)VP3能夠促進(jìn)AKT的磷酸化來促進(jìn)mTOR的磷酸化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VP3能夠誘導(dǎo)VPS34-AK

5、T-PDK1復(fù)合體的形成。通過對VPS34的干擾敲低，發(fā)現(xiàn)AKT不再被磷酸化。通過PDK1抑制劑來抑制PDK1的活性，也能發(fā)現(xiàn)AKT不再磷酸化。因此，VPS34-AKT-PDK1復(fù)合體的形成對于IBDV/VP3誘導(dǎo)的AKT磷酸化是必須的。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)PDK1抑制劑能夠逆反因VP3而抑制的自噬，但是PDK1抑制劑無法恢復(fù)由VP3破壞的VPS34復(fù)合體，因此推測VP3主要是通過促進(jìn)AKT的活性而非通過破壞VPS34-Beclin-1復(fù)合體的方

6、式來抑制自噬的。
　　本文系統(tǒng)的研究了IBDV感染前期和后期細(xì)胞自噬的變化情況，在IBDV侵入的過程中，細(xì)胞通過Hsp90來識別IBDV的外殼蛋白VP2，并因此引發(fā)mTOR依賴的功能性自噬過程。引發(fā)的自噬在清除病毒中起到重要的作用。而IBDV為了能夠成功復(fù)制，在感染過程中，IBDV能夠通過其VP3來促進(jìn)VPS34依賴的AKT活性，并因此而阻斷自噬，促進(jìn)病毒的復(fù)制。因此，病毒蛋白VP2/VP3通過調(diào)控AKT/mTOR信號通路控制著I