腺相關(guān)病毒衣殼自組裝元件VP2、VP3及AAP的制備.pdf

1、背景和目的:目前重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)的應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)入臨床研究的階段,但是對(duì)于一般大動(dòng)物的臨床前研究或試驗(yàn),載體顆粒單批產(chǎn)量要求至少要達(dá)到1015VP(viral particle),這一用藥劑量對(duì)于現(xiàn)行的胞內(nèi)病毒制備是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。而為了達(dá)到臨床研究的標(biāo)準(zhǔn),必須加大成本的投入。面對(duì)這一困境和市場(chǎng)需求,本研究提出了用蛋白質(zhì)元件在細(xì)胞外裝配病毒的構(gòu)想:即通過(guò)基因工程的手段制備病毒組裝所需的各種蛋白和DNA元件,利用自組裝與納米技術(shù)

2、在胞外先組裝成病毒樣顆粒AAV-VLP(Virus-like particle),再衣殼化形成具有活性的病毒。本論文主要任務(wù)就是 AAV2組裝蛋白元件的制備,包括衣殼蛋白VP2和VP3,以及組裝激活蛋白AAP。
　　研究?jī)?nèi)容:首先構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的工程菌GS115-VP2和GS115-VP3,篩選出高表達(dá)菌種后,利用5L發(fā)酵罐進(jìn)行中試規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)VP2和VP3,使用SDS-PAGE,western blot以及質(zhì)譜檢測(cè)等方法進(jìn)

3、行鑒定,經(jīng)過(guò)疏水柱層析,G-25脫鹽以及肝素親和等層析柱的純化獲得了AAV2自組裝元件VP2蛋白和VP3蛋白。
　　其次,使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建工程表達(dá)菌BL21-VP3和BL21-AAP,其中VP3蛋白以包涵體的形式存在,通過(guò)包涵體洗滌,溶解,并且Ni層析柱純化復(fù)性等步驟獲得了可溶的VP3蛋白,可用于多克隆抗體的制備。AAP蛋白在誘導(dǎo)表達(dá)之后,通過(guò)疏水柱,G-25脫鹽,CM柱分離純化,獲得純化的AAP蛋白。
　　研究結(jié)論