小鵝瘟病毒強毒株細胞適應(yīng)毒的培育及其VP3基因的表達.pdf

1、本文采集疑似小鵝瘟(GP)的病死鵝組織，通過鵝胚分離培養(yǎng)，共獲得六株病毒，這些病毒不能凝集雞紅細胞，對雞胚無致死性，在電鏡下為20nm左右的球形無囊膜病毒。利用特異性抗小鵝瘟病毒(GPV)單克隆抗體建立的夾心ELISA方法鑒定，確定分離病毒為GPV。該病毒ELD<,50>為10<'-3.1>/0.2ml。 將GPV-CZ分離株病毒在鵝胚成纖維(GEF)細胞上盲傳，用特異性單克隆抗體進行間接免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)病毒在第9代可以適應(yīng)G

2、EF，在第10代GEF可以檢測到特異性熒光，并且在10代以后可見CPE。用IFA方法測定細胞毒CZ-ca14株感染GEF的最早檢出時間為12小時；測定GPV-CZ-ca株第14代的TCID50為10<'-9.4>/0.2ml，進一步對細胞適應(yīng)毒(命名為GPv-CZ-ca株)的第14代(約10<'9>TCID<,50>)和胚毒(10<'3>ELD<,50>)進行比較，結(jié)果表明GPV-CZ-ca-14對易感雛鵝無致病性，而原代尿囊液胚毒對雛

3、鵝的致死率為100％，說明該病毒在GEF連續(xù)傳代適應(yīng)后病毒毒力逐漸減弱；以約109T℃ID<,50>的量接種無母源抗體的雛鵝，結(jié)果表明中和抗體在接種后22天達到最高峰， GPV-CZ-ca株有望作為GPV弱毒疫苗株的候選毒株。 以感染GPV-CZ-ca株的鵝胚成纖維細胞的DNA為模板，根據(jù)Genbank上公布的B株小鵝瘟病毒的基因序列設(shè)計引物，PCR擴增VP3基因，獲得的PCR產(chǎn)物克隆入oGEX-6P-1中并轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細

4、胞。陽性菌經(jīng)鑒定正確后，用IPTG誘導(dǎo)表達，并進行SDS-PAGE分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VP3基因能夠在原核大腸桿菌中得到高效可溶性表達。對表達條件優(yōu)化結(jié)果表明，在誘導(dǎo)5小時，用不同IPTG濃度誘導(dǎo)，表達產(chǎn)物均呈高效可溶性表達。用濃縮的小鵝瘟病毒抗原免疫Babl/c小鼠制備GPV多抗，進行WESTERN-BLOT實驗，結(jié)果證明VP3與GST融合表達的分子量為84kDa。病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白VP3在大腸桿菌中的可溶性表達對小鵝瘟病毒的深入研究和免疫