小鵝瘟細(xì)胞適應(yīng)毒的培育及其特性的研究.pdf

1、小鵝瘟(GoslingPlague，GP)是危害養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的最嚴(yán)重的傳染病之一。目前主要采用免疫產(chǎn)蛋母鵝，使小鵝獲得母源抗體的方法進(jìn)行該病的預(yù)防，但是小鵝瘟疫情還是時(shí)有發(fā)生。本研究通過(guò)鵝胚分離小鵝瘟病毒，將含病毒的尿囊液進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)篩選出蛋白條帶最佳的病毒，然后在鵝胚成纖維細(xì)胞(GEF)上連續(xù)傳代培養(yǎng)，使之適應(yīng)GEF并致弱，己獲得可以在小鵝使用的小鵝瘟細(xì)胞弱毒疫苗。
　　 采集疑似小鵝瘟的病死鵝組織，通過(guò)鵝胚分離

2、培養(yǎng)，取能致死鵝胚但不能凝集雞紅細(xì)胞的鵝胚尿囊液，用抗GPV的特異性單克隆抗體進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果共得到8株GPV。將分離獲得8株病毒與實(shí)驗(yàn)室保存的6株病毒的尿囊液分別用氯仿處理兩次，經(jīng)PEG6000濃縮十倍，在相同蛋白含量的情況下進(jìn)行SDS-PAGE。比較各個(gè)分離毒的蛋白條帶差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AHTC20100225株VP3含量最高，提示其是抗原性較好病毒，可以進(jìn)行細(xì)胞培育篩選。
　　 將GPVAHTC20100

3、225株和GPV-SYG61株，分別在鵝胚成纖維細(xì)胞(GEF)上連續(xù)盲傳培養(yǎng)，用抗GPV的特異性單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AHTC20100225株從第14代、GPV-SYG61株從第10代開(kāi)始出現(xiàn)特異性熒光，將這兩株細(xì)胞適應(yīng)毒繼續(xù)在GEF上分別培養(yǎng)到第40代和第70代。每隔五代測(cè)一次這兩株細(xì)胞適應(yīng)毒的半數(shù)組織感染量(TCID50)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的TCID50都能穩(wěn)定在10-5/0.2ml左右。用IFA方法確定SYG6

4、1株第70代細(xì)胞適應(yīng)毒（SYG61-g70）感染GEF后的最早檢出時(shí)間為第12h。將SYG61-g70接種易感鵝胚，測(cè)得其鵝胚半數(shù)致死量(ELD50)為10-1.5/0.2ml，遠(yuǎn)高于SYG61-g0的（ELD50為10-6.0/0.2ml），表明其對(duì)鵝胚的致死力降低了3.16×104倍。
　　 將SYG61-g70稀釋后免疫1日齡易感雛鵝，并與正常對(duì)照雛鵝混養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照雛鵝均正常，103個(gè)TCID50的SYG61-g70不

5、能引起雛鵝死亡。用稀釋后的SYG61-g70免疫1日齡雛鵝，然后每隔5天采血，分離血清，用血清中和試驗(yàn)的方法檢測(cè)鵝體內(nèi)抗體變化情況，結(jié)果顯示抗體水平在前15天逐漸升高，效價(jià)最高可達(dá)10-2.84/0.2ml，15天左右緩慢下降，始終維持10-2/0.2ml左右。用稀釋后的SYG61-g70免疫1日齡易感雛鵝，5天后注射102.1個(gè)LD50的GPV強(qiáng)毒JTG20100319，雛鵝全都沒(méi)有死亡，而攻毒對(duì)照組的死亡率為80％，結(jié)果表明625個(gè)