雛鵝新型病毒性腸炎病毒強(qiáng)毒生物學(xué)特性研究.pdf

1、雛鵝新型病毒性腸炎(newtypegoslingviralenteritis，NGVE)是一種主要發(fā)生于30日齡以內(nèi)的雛鵝的一種以小腸出血性、纖維素性、滲出性、壞死性炎癥為特征的急性傳染病。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、病理剖解、病原的分離、初步鑒定、病毒提純與負(fù)染電鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征、及病毒結(jié)構(gòu)蛋白分析等一系列研究，初步認(rèn)為該病是由禽腺病毒引起的雛鵝的一種新型病毒性腸炎。該病目前對(duì)養(yǎng)鵝業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于鵝腺病毒，特別是致病的鵝腺病毒，目前

2、國(guó)內(nèi)外的研究資料很少。電子顯微學(xué)技術(shù)是研究病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)、鑒定新病毒、闡明病毒的發(fā)育循環(huán)、研究感染宿主病理學(xué)的一個(gè)重要方法，它在病毒學(xué)研究中具有不可替代的作用。本研究首先將NGVEV鵝胚尿囊液適應(yīng)10日齡鴨胚，再將NGVEV鴨胚尿囊液適應(yīng)體外培養(yǎng)的鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)，并對(duì)病毒在感染鴨胚體內(nèi)及DEF細(xì)胞上的形態(tài)特征和病毒形態(tài)發(fā)生學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)地研究，同時(shí)觀察被感染宿主細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)病變和細(xì)胞凋亡的情況，以期了解NGVEV的入侵、分布及釋放

3、特點(diǎn)，為揭示該病毒致宿主細(xì)胞病變的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　 通過人工感染NGVEV-CN強(qiáng)毒而復(fù)制出NGVE急性病例，建立并利用間接免疫酶組織化學(xué)SP法及間接免疫熒光抗體法探究NGVEV對(duì)感染雛鵝組織的侵染特點(diǎn)及病毒抗原隨感染時(shí)間延伸在宿主體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布規(guī)律，同時(shí)對(duì)病毒誘導(dǎo)雛鵝宿主的細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，以期為闡明該病的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及為NGVEV的實(shí)驗(yàn)室診，斷提供科學(xué)的方法。
　　 將制備的NGVEV滅活疫苗及添加G

4、oIL-2的NGVEV滅活疫苗免疫青年鵝，對(duì)其誘導(dǎo)鵝產(chǎn)生的體液免疫抗體水平和細(xì)胞免疫抗體水平進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，確定了該疫苗的免疫原性和最佳免疫劑量。進(jìn)而將該疫苗免疫開產(chǎn)前種鵝，對(duì)免疫種鵝的血清抗體水平、免疫種鵝的后代卵黃抗體消長(zhǎng)規(guī)律及后代雛鵝的攻毒免疫保護(hù)力進(jìn)行監(jiān)控，為研制高效NGVEV滅活疫苗提供科學(xué)依據(jù)，為防治雛鵝新型病毒性腸炎的提供了新的手段。
　　 本研究獲得以下系列結(jié)果：
　　 1.雛鵝新型病毒性腸炎病毒CN強(qiáng)毒株感

5、染鴨胚宿主細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化和病毒形態(tài)發(fā)生學(xué)：在不同時(shí)間剖殺的和死亡的鴨胚的尿囊膜、心、肝、腸、腦及肌胃中均發(fā)現(xiàn)NGVEV粒子，其直徑以70nm-80nm為主，以散在的形式分布，多見于細(xì)胞核內(nèi)。NGVEV粒子通過與細(xì)胞膜的特異性吸附而進(jìn)入宿主細(xì)胞，裝配成熟的病毒粒子通過細(xì)胞核膜及細(xì)胞膜破裂的方式被釋放。被NGVEV感染宿主細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)病變以細(xì)胞核膜嚴(yán)重的擴(kuò)張，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹，線粒體嵴斷裂溶解成空泡樣為主，其中尿囊膜上皮細(xì)胞中線粒體的凝集

6、、固縮變化是該病毒引起的特征性超微病變。
　　 2.雛鵝新型病毒性腸炎病毒CN強(qiáng)毒株對(duì)體外培養(yǎng)的鴨胚成纖維細(xì)胞的適應(yīng)及其增殖規(guī)律：將NGVEV鴨胚尿囊液感染DEF細(xì)胞并經(jīng)連續(xù)傳代獲得了適應(yīng)DEF細(xì)胞生長(zhǎng)的NGVEV-CN細(xì)胞毒。細(xì)胞病變一般出現(xiàn)于感染后72h，到120h細(xì)胞病變達(dá)80％。NGVEV在DEF上的病毒滴度(TCIDso)隨傳代次數(shù)增加而逐漸增加，直到第5代后維持在較高的水平。病毒滴度隨感染時(shí)間變化表現(xiàn)為：感染初期首先

7、呈現(xiàn)一個(gè)下降過程，4h后毒價(jià)開始迅速上升，于96h-144h病毒滴度達(dá)到并維持最高水平。NGVEV感染DEF細(xì)胞后96h-120h是收獲該NGVEV細(xì)胞毒的最適時(shí)間。
　　 3.雛鵝新型病毒性腸炎病毒CN強(qiáng)毒株感染鴨胚成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化和病毒形態(tài)發(fā)生學(xué)：NGVEV在DEF細(xì)胞中呈圓形，無囊膜，直徑為75nm-90nm。病毒粒子多散在于細(xì)胞核內(nèi)和集中分布于胞漿空泡內(nèi)。NGVEV粒子通過吸附于DEF細(xì)胞膜表面而進(jìn)入細(xì)胞，成熟的

8、病毒粒子經(jīng)由細(xì)胞核膜的破裂而進(jìn)入胞漿，再通過出芽、細(xì)胞膜破裂及細(xì)胞空泡破裂的方式被釋放出細(xì)胞。被NGVEV感染的DEF細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)病變主要表現(xiàn)為：線粒體的固縮及聚集變化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞漿出現(xiàn)空泡或空池樣結(jié)構(gòu)，及細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。伴隨著病毒的復(fù)制、裝配和成熟，細(xì)胞中還出現(xiàn)大量的不規(guī)則形狀的高電子致密物及三種不同特點(diǎn)的胞漿包涵體結(jié)構(gòu)。
　　 4.雛鵝新型病毒性腸炎病毒CN強(qiáng)毒株致體外培養(yǎng)的鴨胚成纖維細(xì)胞凋亡：光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡

9、觀察到NGVEV可誘導(dǎo)DEF細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到感染細(xì)胞核酸降解為不同倍數(shù)的180bp-200bp的典型梯狀條帶；用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記感染DEF細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的比率從感染后48h隨感染時(shí)間延伸而明顯增加，于120h達(dá)到凋亡峰，而AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記的感染DEF細(xì)胞經(jīng)熒光顯微鏡可觀察陽性熒光信號(hào)的凋亡細(xì)胞。
　　 5.雛鵝新型病毒性腸炎病毒

10、的提純、超微形態(tài)觀察和兔抗NGVEV高免血清IgG的鋇備：通過對(duì)NGVEV純化方法的比較研究，確定以結(jié)合差速離心、氯仿處理、氯化銫不連續(xù)梯度和等密度梯度超速離心的方法來純化NGVEV。通過該方法不僅可獲得較純凈、多量的NGVEV粒子，還可區(qū)分完整的NGVEV粒子和不完整的病毒粒子。經(jīng)負(fù)染電鏡觀察發(fā)現(xiàn)完整的NGVEV粒子具有腺病毒典型形態(tài)特征：圓形，無囊膜，直徑75nm-90nm，核心、核衣殼及殼粒清晰可見。最后，以純化的病毒為免疫原成功

11、制備了兔抗NGVEV的高免血清，并通過辛酸-硫酸銨粗提及HighO陰離子交換柱純化兔抗NGVEV的血清IgG。
　　 6.建立并應(yīng)用間接免疫酶組織化學(xué)SP法和間接免疫熒光抗體法檢測(cè)雛鵝新型病毒性腸炎病毒在人工感染雛鵝組織的定位和侵染規(guī)律：以純化的兔抗NGVEV的血清IgG為一抗，分別建立檢測(cè)石蠟切片NGVEV的間接免疫酶組織化學(xué)SP法和間接免疫熒光雙染法，并應(yīng)用該方法研究NGVEV-CN強(qiáng)毒株在人工感染雛鵝組織中病毒定殖及動(dòng)態(tài)侵

12、染規(guī)律。結(jié)果表明：NGVEV抗原主要侵染免疫器官（法氏囊，胸腺，哈德氏腺及脾）和胃腸道器官（腺胃，肌胃及腸道），推測(cè)這些器官是NGVEV進(jìn)入機(jī)體后首先侵染靶部位并增殖子代病毒，之后子代病毒通過血液、淋巴液或組織液而釋放到其他實(shí)質(zhì)性組織，使得機(jī)體在感染后期呈現(xiàn)NGVEV廣泛性侵染（除呼吸器官）。被NGVEV侵染的細(xì)胞數(shù)量隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而增加，直到感染后15d。NGVEV侵染的細(xì)胞主要包括：各種淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)

13、胞、成纖維細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、腺細(xì)胞等等。
　　 7.雛鵝新型病毒性腸炎病毒CN強(qiáng)毒株致雛鵝宿主細(xì)胞凋亡的研究：通過光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡對(duì)人工感染雛鵝各個(gè)組織的宿主細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)，最先于NGVEV感染3d時(shí)在法氏囊中觀察到呈凋亡變化的淋巴細(xì)胞，之后凋亡細(xì)胞廣泛出現(xiàn)于免疫器官（法氏囊，胸腺及哈德氏腺）和消化器官（腺胃，肌胃，腸道及肝），而氣管和肺極少出現(xiàn)細(xì)胞凋亡變化。進(jìn)一步用瓊脂糖凝膠電泳和原位末端標(biāo)記方法（TUNEL）對(duì)NGVEV感

14、染宿主細(xì)胞核酸的降解情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)被感染鵝的免疫器官和胃腸道均出現(xiàn)典型的不同倍數(shù)的180bp-200bp的梯狀條帶，在經(jīng)TUNEL染色的組織切片中觀察到了棕色陽性信號(hào)的凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的數(shù)量隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而增多，于9d-12d達(dá)到最大值。
　　 8.雛鵝新型病毒性腸炎病毒滅活疫苗對(duì)青年鵝的免疫原性研究及重組GoIL-2對(duì)疫苗的佐劑效應(yīng)研究：不同劑量的NGVEV滅活疫苗均能顯著提高免疫青年鵝的細(xì)胞免疫和體液免疫抗體水平，且

15、抗體水平與免疫劑量有一定關(guān)系，NGVEV滅活疫苗以o.5ml/只為最佳免疫劑量。單獨(dú)使用GoIL-2可提高機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，但是不能使機(jī)體產(chǎn)生特異性抗NGVEV抗體。添加不同劑量GoIL-2的NGVEV滅活疫苗能極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)提高被免疫鵝細(xì)胞免疫和體液水平，且抗體水平與GoIL-2劑量有一定關(guān)系，以1000U/只為最佳劑量。研究表明，免疫后第28d青年鵝的血清抗NGVEV的IgG水平、中和抗體水平及細(xì)胞免

16、疫水平達(dá)到最高，且在免疫后第175d都維持在一個(gè)較高的水平。
　　 9.雛鵝新型病毒性腸炎病毒滅活疫苗對(duì)開產(chǎn)前種鵝的免疫效果評(píng)價(jià)：NGVEV滅活疫苗與添加GoIL-2的NGVEV滅活疫苗免疫后5-6個(gè)月內(nèi)對(duì)免疫種鵝所產(chǎn)后代產(chǎn)生確實(shí)的保護(hù)效果，其中以添加GoIL-2的滅活疫苗免疫種鵝所孵出的后代雛鵝的攻毒100％免疫保護(hù)效果更持久。另外，被免疫母鵝血清抗體水平、其所產(chǎn)蛋的卵黃抗體水平與后代雛鵝攻毒免疫保護(hù)效果呈現(xiàn)正相關(guān)性，因此建議