人源抗HBsAg dsFv抗體靶向干擾素復(fù)合基因的克隆和表達(dá).pdf

1、抗體技術(shù)經(jīng)歷血清多克隆抗體、單克隆抗體階段后發(fā)展到了第三代抗體-基因工程抗體。我們在前期研究中通過噬菌體抗體庫篩選到人源抗HBsAg基因工程抗體,利用PCR定點(diǎn)突變獲得二硫鍵穩(wěn)定的dsFv(disufide—stabilized Fv fragments)抗體,但抗體的輕鏈與干擾素α的融合基因和重鏈基因分別克隆于pCI—neo和pCdhfrl兩個質(zhì)粒中,需要共轉(zhuǎn)染細(xì)胞才能獲得表達(dá)。本研究擬在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索改進(jìn),整體思路是將人源抗HB

2、sAgdsFv抗體的輕鏈-干擾素α融合基因和重鏈基因通過自身切割肽F2A連接置于同一開放讀碼框,實(shí)現(xiàn)抗體的輕鏈和重鏈在同一質(zhì)粒中的串聯(lián)表達(dá)。
　　 首先在過渡載體pCI—GPI中構(gòu)建抗體靶向干擾素復(fù)合基因:即通過重疊延伸PCR法將dsFv抗體重鏈基因Ⅷ的3’端融入一段帶正電荷的DNA負(fù)載區(qū)基因,使目的蛋白帶正電荷,以結(jié)合帶負(fù)電的質(zhì)粒DNA；并在抗體輕鏈-干擾素α融合基因3’端連入6×His標(biāo)簽,以方便表達(dá)蛋白的檢測和純化。通過自

3、身切割肽F2A將人源抗HBsAg dsFv抗體的輕鏈復(fù)合基因和重鏈復(fù)合基因連接置于同一開放讀碼框,并在過渡載體pCI—GPI中實(shí)現(xiàn)輕、重鏈復(fù)合基因的連接即得到重組質(zhì)粒pCIGPI—dsFva pr+。
　　 其次,選擇哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲細(xì)胞／桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)抗體靶向干擾素重組復(fù)合基因。即在構(gòu)建好pCIGPI—dsFva pr+的基礎(chǔ)上,把抗體靶向干擾素復(fù)合基因通過酶切和PCR等方法克隆入真核表達(dá)載體pEE14.1及桿

4、狀病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移載體pAcGP67A,從而獲得含抗體靶向干擾素復(fù)合基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pEE14.1-dsFva pr+和pAcGP67A—dsFva pr+,并分別在哺乳動物細(xì)胞CHO-K1和昆蟲細(xì)胞Sf9中驗(yàn)證其表達(dá)。此外,我們還把哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲細(xì)胞／桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的上清中的目的蛋白分別進(jìn)行了純化,并對其進(jìn)行了初步驗(yàn)證。
　　 總之,含抗體靶向干擾素重組基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲細(xì)胞／桿狀