上海、山西地區(qū)HIV-1分離株vif基因序列分析.pdf

1、HIV-1的特點(diǎn)之一是具有多個調(diào)節(jié)基因,這些基因可編碼相應(yīng)的調(diào)控蛋白,如Nef、Tat、Rev、Vif,Vpr、Vpx、Vpu等,它們在RNA轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、蛋白質(zhì)翻譯直到病毒顆粒從細(xì)胞膜釋放的過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 HIV-1Vif蛋白,即人類免疫缺陷病毒的病毒感染性因子由vif基因編碼,是一個23kDa的病毒附屬蛋白,為病毒在特定類型細(xì)胞中復(fù)制所必需[1],[2]。Vif的主要功能是與細(xì)胞胞嘧啶脫氨酶家族(APO

2、BEC3)相互作用[3,4],通過降解宿主蛋白APOBEC3G/F,使病毒在準(zhǔn)許細(xì)胞中順利復(fù)制。此外Vif蛋白還可與Pr55Gag、病毒RNA(gRNA)相互作用,參與病毒的裝配。國外已有研究關(guān)于vif序列特征以及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系,但國內(nèi)尚缺乏相關(guān)資料。
　　 本實驗使用PCR等分子生物學(xué)方法,對2008年至2009年收集的我國上海及山西兩地HIV-1感染者血漿病毒基因中vif基因進(jìn)行擴(kuò)增、序列測定和分析,研究其變異特征,評價

3、Vif的重要功能區(qū)的保守程度;探討兩地感染者HIV-1vif基因變化與患者的疾病狀態(tài)間的相關(guān)性,為深入了解我國HIV-1的致病機(jī)理提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 收集我國上海、山西地區(qū)38名HIV-1感染者的流行病學(xué)資料、臨床資料及血漿標(biāo)本。使用TRIzol和QIAGENMiniViralkit從血漿標(biāo)本中抽提得到病毒RNA,以vif基因區(qū)特異性下游引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,后進(jìn)行巢式PCR。1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測目的

4、片段。與分子量Marker比對無誤后,純化回收產(chǎn)物并送測序。使用CLUSTALW程序進(jìn)行序列排列比對。檢索HIVDatabase得到78條HIV-1Vif參考株序列,MEGA4.0程序生成系統(tǒng)進(jìn)化樹,初步判定亞型,計算基因系統(tǒng)發(fā)育離散度。分析Vif重要功能結(jié)構(gòu)域氨基酸的變化。使用VESPA軟件得到特征性氨基酸序列。STATA軟件分析特殊位點(diǎn)與疾病狀態(tài)間的統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 共對17份上海標(biāo)本(包含1例來自河

5、南的感染者,在上海治療)和21例山西標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增。38例血漿標(biāo)本擴(kuò)增后得到31例vif基因,7例擴(kuò)增結(jié)果為陰性,其中5例屬于長期不進(jìn)展者,2例為AIDS。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果,上海地區(qū)11例感染者屬于CRF01_AE亞型,其余20例感染者屬于B亞型。兩個亞型與相應(yīng)的國際參考株間的基因距離均小于與其他亞型間的基因距離。Vif蛋白重要功能結(jié)構(gòu)域N-端色氨酸富集區(qū)、鋅指結(jié)構(gòu)H108-X5-C114-X18-C133-X5-H139、14

6、4SLQYLA149qψψψψ、161PPLP164及部分位點(diǎn)均為保守區(qū),而部分與APOBEC3G相互作用的位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)等,在TP組和LTNP組均存在變化。通過與不包括中國毒株在內(nèi)的世界五大洲的相同亞型的代表序列比對,發(fā)現(xiàn)11例CRF01_AE序列有3個特征性氨基酸位點(diǎn)(aa94,aa180,aa185),20例B'亞型序列有6個特征性氨基酸位點(diǎn)(aa6,aa90,aa98,aa135,aa157,aa185)。Vif132位的S/

7、R,159位的R/I與患者疾病狀態(tài)間存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.上海地區(qū)性傳播感染者中CRF01AE亞型常見。山西聞喜地區(qū)非法鮮血感染者以B'亞型為主?？赡芸梢岳胿if基因可以做粗略分型;
　　 2.Vif132位的S/R可能與患者的CD4+T水平高低有關(guān)聯(lián);
　　 3.Vif蛋白的重要功能序列為保守區(qū);
　　 4.AIDS與LTNP兩組的Vif氨基酸序列中的磷酸化位點(diǎn)、結(jié)合APO