細(xì)胞外HSP70-PCs通過(guò)TLR2-4-JNK1-2MAPK通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的惡性腫瘤之一，目前我國(guó)肝癌患者死亡率居高不下。根據(jù)現(xiàn)有認(rèn)識(shí)，慢性肝損害刺激肝細(xì)胞過(guò)度增殖是肝細(xì)胞肝癌發(fā)生的主要病理機(jī)制之一。熱休克蛋白(heat shock Protein，HSP)又稱應(yīng)激蛋白，廣泛存在于原核、真核細(xì)胞中，進(jìn)化上高度保守。在HSP家族中，HSP70亞族在細(xì)胞內(nèi)的含量最多，免疫原性最強(qiáng)，因此成為研究的重點(diǎn)。我們認(rèn)為HSP70作用的多樣性，除了與受到的應(yīng)激刺激多樣和分布的

2、細(xì)胞種類(lèi)有關(guān)外，主要與HSP70在組織中的分布位置有關(guān)。根據(jù)HSP70在組織中的不同分布，可以將其分為細(xì)胞內(nèi)HSP70和細(xì)胞外HSP70。在某些病理狀態(tài)下，如腫瘤進(jìn)展或炎癥反應(yīng)中，細(xì)胞內(nèi)HSP70及HSP70肽復(fù)合物（HSP70-Peptide Complexes，HSP70-PCs）可以通過(guò)分泌、胞吐和細(xì)胞破裂、壞死而被釋放到細(xì)胞外。釋放到細(xì)胞外的HSP70/HSP70-PCs能調(diào)控腫瘤的多種生物學(xué)行為，包括增殖，侵襲等。但是，細(xì)胞外

3、HSP70/HSP70-PCs是跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制目前尚不清楚。Toll樣受體(TLRs)是一類(lèi)天然免疫受體家族，在機(jī)體的固有免疫反應(yīng)中起重要作用。TLRs能夠識(shí)別不同外源性刺激并將信號(hào)進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞釋放大量物質(zhì)，包括HSP70、TNF-α等?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)包括肝癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞表面均有TLRs的表達(dá)。那么在肝癌細(xì)胞中，細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs是否通過(guò)TLRs介導(dǎo)的跨膜作用發(fā)揮其功能？細(xì)胞外H

4、SP70/HSP70-PCs又是通過(guò)哪些轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)細(xì)信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而活化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖？本研究我們首先檢測(cè)肝癌組織中TLRs的表達(dá)情況，然后研究細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌細(xì)胞增殖的改變，探討TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化途徑。
　　方法：
　　1、應(yīng)用MTT對(duì)比細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌細(xì)胞株增殖的改變。然后阻斷TLR2與TLR4檢測(cè)細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs對(duì)

5、肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　2、應(yīng)用western blot與real-time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs對(duì)TLR2、TLR4表達(dá)的影響;應(yīng)用免疫共沉淀、GST Pull Down與放線菌酮檢測(cè)HSP70與TLR2、TLR4之間的關(guān)系。
　　3、利用western blot檢測(cè)和對(duì)比HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌細(xì)胞JNK1/2、Cyclin D1蛋白的表達(dá)情況。然后檢測(cè)阻斷JNK1/2

6、后HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細(xì)胞株Cyclin D1蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細(xì)胞HepG2后明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，而同時(shí)阻斷TLR2與TLR4能抑制細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs對(duì)肝癌細(xì)胞的促增殖作用。
　　2、細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細(xì)胞HepG2后TLR2、TLR4蛋白mRNA與蛋白明顯增加;細(xì)胞外HSP70/HSP70

7、-PCs能夠與TLR2、TLR4形成復(fù)合物并上調(diào)其穩(wěn)定性發(fā)揮其作用。
　　3、細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細(xì)胞HepG2后p-JNK1/2、Cyclin D1表達(dá)明顯增加，阻斷JNK1/2后Cyclin D1表達(dá)明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1、細(xì)胞外HSP70/HSP70-PCs促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖是通過(guò)與TLR2、TLR4形成復(fù)合物并上調(diào)其穩(wěn)定性發(fā)揮作用。
　　2、細(xì)胞外HSP70/HSP70-PC