次郎柿與上西早生柿ACC氧化酶的轉基因研究.pdf

1、本研究以次郎柿與上西早生柿兩種甜柿組培苗葉片為外植體，通過對抗生素篩選條件和根癌農(nóng)桿菌介導次郎柿與上西早生柿遺傳轉化條件的優(yōu)化，建立了次郎柿與上西早生柿遺傳轉化體系，將ACC氧化酶的RNAi基因導入次郎柿與上西早生柿組培苗中，以期通過轉基因的方法抑制ACC氧化酶的表達，提高躍變型果實的耐貯性能。主要取得以下研究結果: 1.次郎柿轉基因體系的建立 1.1研究了抗生素對葉片再生的影響，確定了適宜的抗生素濃度。 通過次

2、郎柿葉片及組培苗對抗生素的敏感性試驗，結果表明:在抗性苗生長過程中，用200mg/L頭孢霉素和30mg/L壯觀霉素做為篩選轉化抗性苗的篩選濃度。 1.2次郎柿轉基因工藝路線采用繼代四年半的組培苗，取其頂端2～3片剛展開的嫩葉，從葉基部剪取4mm×4mm大小的葉片，葉背朝上，接種在DKW(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L的培養(yǎng)基上:暗預培養(yǎng)4d后，用OD600值為0.5的菌液濃度侵染葉片lOmin，侵染時加入5

3、0mg/L的乙酰丁香酮。將侵染后的葉片外植體，再轉到DKW(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L，的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d，之后移入DKW(1/2N)+ZT1.0 mg/L+TDZ0.5mg/L+Cef200mg/L的培養(yǎng)基上黑暗脫菌培養(yǎng)3d;最后轉入DKW(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L+Cef200mg/L+Sp30mg/L的培養(yǎng)基上光照選擇培養(yǎng)，每25d繼代一次。繼代7～8次后轉入DKW+ZT1.

4、0mg/L+Sp30mg/L+Cef200mg/L的培養(yǎng)基中。獲得了次郎柿ACC氧化酶的RNAi轉基因苗。經(jīng)GUS染色及PCR檢測得到27株轉基因植株。 2.上西早生柿轉基因體系的建立 2.1研究了抗生素對葉片再生的影響，確定了適宜的抗生素濃度。 通過上西早生柿葉片及組培苗對抗生素的敏感性試驗，結果表明:在抗性苗生長過程中，用200mg/L頭孢霉素和30mg/L，壯觀霉素做為篩選轉化抗性苗的篩選濃度。 2

5、.2上西早生柿轉基因工藝路線采用繼代四年半的組培苗，取其頂端2～3片剛展開的嫩葉，從葉基部剪取4mm×4mm大小的葉片，葉背朝上，接種在DKW(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L的培養(yǎng)基上；暗預培養(yǎng)3d后，用OD600值為0.3的菌液濃度侵染葉片10min，侵染時加入100mg/L的乙酰丁香酮。將侵染后的葉片外植體，再轉到DKW(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)4d，之后移入DKW(

6、1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L+Cef200mg/L的培養(yǎng)基上黑暗脫菌培養(yǎng)3d；最后轉入DKw(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/l+Cef200mg/L+Sp30mg/l的培養(yǎng)基上光照選擇培養(yǎng)，每25d繼代一次。繼代7～8次后轉入DKW+ZT1.0mg/L+Sp30mg/l+Cef200mg/L的培養(yǎng)基中。獲得了上西早生柿ACC氧化酶的RNAi基因轉基因苗。經(jīng)GUS染色及PCR檢測得到4株轉基因植