上西早生柿ETR5基因片段的克隆與植物表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、柿果屬于躍變型果實(shí)，采收后極易軟化，給柿果的貯藏運(yùn)輸帶來不便。大量研究證實(shí)，乙烯是躍變型成熟果實(shí)的催熟劑。躍變型果實(shí)中自我催化的乙烯合成反應(yīng)啟始后，合成大量乙烯。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)抑制或降低果實(shí)乙烯的生物合成，可以降低果實(shí)乙烯的含量。而乙烯只能與受體結(jié)合后才能啟動(dòng)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，完成果實(shí)完熟過程。本研究以柿葉片為材料，克隆分離了ETR5基因，成功構(gòu)建了干擾表達(dá)載體，結(jié)果如下: 1.利用Rneasy(R) Plant Mini

2、Kit試劑盒成功提取了高質(zhì)量的RNA，RNA的OD260/OD280比值為2.0896，為mRNA的反轉(zhuǎn)錄奠定了基礎(chǔ)。 2.mRNA的反轉(zhuǎn)錄采用了QIAGEN公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，分離到完整性好的mRNA，為繼后的RT-PCR提供可靠保證。 3.根據(jù)已發(fā)表的植物ETR保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)長(zhǎng)549bp的片段，經(jīng)序列分析證明該片段具有的保守區(qū)氨基酸序列。 4.通過分析已獲

3、得ETR5基因片段，用PCR法去除內(nèi)含子，并將得到的片段轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中經(jīng)過鑒定及測(cè)序，證明去除內(nèi)含子的基因片段。 5.設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物分別含有酶切位點(diǎn)XbaI和SacI、SmaI和SacI，用PCR法將酶切位點(diǎn)克隆到ETR5基因序列上。 6.得到兩條長(zhǎng)度不同且分別含有XbaI和SacI、SmaI和SacI酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物后，以限制性內(nèi)切酶SacI分別消化后，用T4DNA連接酶將酶切大片段連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHt