水稻硅轉(zhuǎn)運子基因的克隆與表達載體的構(gòu)建.pdf

1、水稻是一種典型的硅積累型植物，其旺盛生長和高產(chǎn)能力對硅的需求量很大。硅元素對提高農(nóng)作物的抗逆性起著重要的作用，包括緩解真菌感染和蟲害，減輕其它非生物脅迫，提高光截獲能力，減小蒸騰損失。但是不同農(nóng)作物的硅含量差別很大，從0.1％到10％不等；如何提高農(nóng)作物對硅元素的吸收以加強其抗逆性是一個亟待解決的問題。水稻硅元素的轉(zhuǎn)運子及其轉(zhuǎn)運機理研究的較為清楚，水稻根部的轉(zhuǎn)運子負責硅元素的轉(zhuǎn)運，轉(zhuǎn)運子決定水稻對硅元素轉(zhuǎn)運的能力。編碼水稻硅轉(zhuǎn)運子Lsi

2、1、Lsi2的兩個基因Lsi1、Lsi2的研究已經(jīng)在Nature雜志(2006-2007)上發(fā)表。Lsi1，mRNA全長897bp，在根部特異表達，編碼的轉(zhuǎn)運子Lsi1具有將硅元素從外界溶液轉(zhuǎn)運到根細胞中的作用；Lsi2，mRNA全長1419bp，也是在根部特異表達，編碼的轉(zhuǎn)運子Lsi2具有將硅元素從根細胞轉(zhuǎn)運到中柱中的作用。但是國內(nèi)有關水稻硅元素轉(zhuǎn)運子及其基因Lsi1、Lsi2的研究還未見報道。在前人研究的基礎上，本研究以寧粳28為材

3、料，利用DNA重組技術(shù)克隆水稻硅元素轉(zhuǎn)運子基因Lsi1、Lsi2、構(gòu)建其表達載體，以期通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)應用到農(nóng)作物中，提高硅元素的轉(zhuǎn)運能力，增加抗逆性。
　　 根據(jù)NCBI中Lsi1、Lsi2的cDNA序列設計兩對上下游引物，通過RT-PCR從水稻寧粳28幼根的總RNA中擴增Lsi1、Lsi2的cDNA序列，分別克隆到pMD18-T載體中。通過PCR鑒定、酶切鑒定以及測序鑒定篩選出正確的克隆定名為pMD18-T-Lsi1、pMD1

4、8-T-Lsi2。將pMD18-T-Lsi1、pMD18-T-Lsi2載體，pCAMBIA2300-35S-OCS載體分別用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和 PstⅠ酶切，然后將目的片段分別連接起來。通過PCR鑒定與酶切鑒定篩選出正確的克隆定名為pCAMBIA2300-35S-Lsi1-OCS和pCAMBIA2300-35S-Lsi2-OCS。為了進一步研究所克隆的Lsi1、Lsi2表達蛋白的情況，構(gòu)建原核表達載體pET-22b(+)-Lsi1與

5、pET-22b(+)-Lsi2，并初步研究了原核表達載體原核表達融合蛋白的情況。最后采取電擊轉(zhuǎn)化法將載體pCAMBIA2300-35S-Lsi1-OCS、pCAMBIA2300-35S-Lsi2-OCS分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。
　　 研究結(jié)果：(1)克隆得到基因Lsi1、Lsi2，并構(gòu)建出克隆載體pMD18-T-Lsi1、pMD18-T-Lsi2；測序表明，擴增得到的Lsi1、Lsi2的cDNA序列與NCBI中的同源性均

6、為100％；(2)構(gòu)建出原核表達載體pET-22b(+)-Lsi1與pET-22b(+)-Lsi2，其原核表達結(jié)果符合預期；(3)構(gòu)建出植物表達載體pCAMBIA2300-35S-Lsi1-OCS、pCAMBIA2300-35S-Lsi2-OCS，并成功將它們轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。
　　 水稻硅元素轉(zhuǎn)運子基因Lsi1、Lsi2的克隆及表達載體的構(gòu)建，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育硅元素轉(zhuǎn)運能力較強，抗逆性較高，產(chǎn)量較大的農(nóng)作物新品種