蠟梅Pollen specific protein基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、蠟梅學(xué)名：Chimonanthus praecox（L．）Link，英文名：Wintersweet，科名：蠟梅科Calycanthaceae。蠟梅為落葉灌木，原產(chǎn)于我國江蘇、浙江、安徽、湖北、江西和陜西等地。在我國栽培己久，是有名的色香俱佳的冬季花卉，花期長達(dá)3個(gè)月之久?；商崛》枷阌汀⒉榻舛旧蛩?，花蕾油治燙傷，根、莖能作鎮(zhèn)咳、止喘藥。然而作為一種名貴花卉，對(duì)蠟梅的分子生物學(xué)研究卻并不多見。 在分子生物學(xué)技術(shù)不斷取得前進(jìn)的前

2、提下，人們發(fā)現(xiàn)在植物的花藥發(fā)育和花粉成熟過程中，有大量的基因表達(dá)，其中有許多是花藥和花粉組織特異性的，目前花藥和花粉特異性表達(dá)的基因及其調(diào)控序列已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)的研究內(nèi)容主要是：從本試驗(yàn)室已構(gòu)建的蠟梅 cDNA文庫中分離克隆了pollen specific protein基因，對(duì)其進(jìn)行了分子特性分析以及對(duì)其可能的功能進(jìn)行功能預(yù)測，并且構(gòu)建了該pollen specific protein基因的表達(dá)載體，其主要研究如下

3、： 1．克隆子的獲得從本實(shí)驗(yàn)室已建完成的cDNA文庫中隨機(jī)挑選文庫克隆，提取質(zhì)粒DNA，采用ABI3700 DNA Sequence DNA自動(dòng)序列測定儀進(jìn)行正向序列測定得到EST序列（pspressed sequence tags，ESTs） DW223488。根據(jù)EST，以文庫克隆載體pTrip1Ex2引物擴(kuò)增出約900bp的特異片段，推斷其為EST序列所對(duì)應(yīng)的全長cDNA。 2．序列特征分析對(duì)目標(biāo)基因在NCBI（h

4、ttp：//www．ncbi．nlm．nih．gov/）上比對(duì)分析。發(fā)現(xiàn)該基因由815個(gè)核苷酸組成，包含一個(gè)480個(gè)核苷酸的ORF，編碼蛋白長159個(gè)氨基酸。該蛋白理論分子量為17．5kD，預(yù)測等電點(diǎn)為6．24。BlastN分析發(fā)現(xiàn)和擬南芥的SAH7基因最相似；BlastP比對(duì)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)克隆子的EST序列與100條蛋白質(zhì)序列存在不同程度的相似性，其中排在第一位的與核苷酸比對(duì)的結(jié)果接近，是葡萄中的花粉特異蛋白pollen—specific

5、protein[Vitis pseudoreticulata]（ABC86745）；BlastX分析，它與40個(gè)花粉特異蛋白有較高的同源性，其中與葡萄中鑒定的花粉特異蛋白同源性最高，Identities達(dá)59％。蛋白質(zhì)同源性分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，初步推斷其功能屬性可能與花粉特異蛋白有關(guān)。 3．蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)預(yù)測從其最大ORF一級(jí)結(jié)構(gòu)分析其分子量為17540．9不含有Trp，Asx，Glx，Xaa四種氨基酸。其原子組成為C759H1

6、207N213O240S12．吸收峰值在280nm處，預(yù)測的半衰期為30小時(shí)；在疏水性的分析中發(fā)現(xiàn)該pollen specific protein疏水性的最大值是3．178，最小值為—2．456，其親水區(qū)域和疏水區(qū)域交錯(cuò)排列；而將目標(biāo)基因利用SignaIP進(jìn)行信號(hào)肽分析（www．cbs．dtu．dk/services/signaIP），所有計(jì)算結(jié)果均為“Yes”，該蛋白具有信號(hào)肽。 4．表達(dá)載體的構(gòu)建Cppsp1基因在克隆載體p