大豆貯藏蛋白基因Gy5的克隆及植物表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、該研究根據(jù)Genebank發(fā)表的大豆11S球蛋白Gy5的cDNA序列,應(yīng)用DNAstar生物軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)引物.用經(jīng)過改良的異硫氰酸胍法提取大豆未成熟種子的總RNA.用RT-PCR法擴(kuò)增出目的片段,用EcoRI/PstI酶切后與pUC19載體連接,重組質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌.穿刺培養(yǎng)的菌株送交寶生物工程有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明所擴(kuò)增的片段符合預(yù)先設(shè)計(jì),基因長度為1704bp,堿基準(zhǔn)確率為99.6％.經(jīng)氨基酸編碼分析,有3個(gè)堿基為兼并

2、子,其他3個(gè)堿基導(dǎo)致兩個(gè)氨基酸有差異,氨基酸序列的同源性為99.6％.將此片段與具有CaMV35S啟動(dòng)子的表達(dá)載體pCAMBIA1301連接,構(gòu)建了含有大豆貯藏蛋白基因Gy5的植物表達(dá)載體.用反復(fù)凍融法將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中,用共培養(yǎng)法將Gy5導(dǎo)入煙草葉片,在已獲得的再生植株中,經(jīng)抗性選擇和PCR檢測(cè)獲得了轉(zhuǎn)化植株.該研究克隆了一個(gè)優(yōu)良種子貯藏蛋白質(zhì)基因,初步證實(shí)了所構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化載體能夠?qū)⒋蠖狗N子貯藏蛋白基因Gy5導(dǎo)

3、入植物體并得到表達(dá),為將其轉(zhuǎn)移到同種或異種植物中,以提高其種子蛋白質(zhì)含量和改善種子蛋白質(zhì)品質(zhì)的深入研究奠定了基礎(chǔ).此外,該研究對(duì)富含蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)的組織或器官(如種子)的RNA提取方法進(jìn)行了研究和改良.用改進(jìn)后的方法所提取的RNA樣品,經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定,OD<,260/280>=1.9~2.0,OD<,260/230>>2.0,RNA提取率達(dá)0.05mg/g;經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,可看到28S和18S兩條清晰的帶,且前者帶寬

4、,說明RNA沒有降解.此研究提高了RNA的提取效率和質(zhì)量,建立了一種高效提取RNA的方法.該研究還對(duì)RT-PCR的條件從逆轉(zhuǎn)錄體系中模板RNA的用量、PCR體系中引物濃度、退火溫度等幾個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化.確定在20ul逆轉(zhuǎn)錄體系中最佳模板RNA用量為1.5ug;PCR體系中最佳引物濃度為1pmol/ul;最佳退火溫度為50℃.當(dāng)用RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行二次PCR時(shí),可能是由于體系成分的改變,在退火溫度為50℃時(shí)出現(xiàn)非特異帶,所以對(duì)其退火溫度