蓖麻毒蛋白A鏈基因的克隆及重復(fù)表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、蓖麻是世界十大油料作物之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與市場(chǎng)地位，被廣泛應(yīng)用于化工、航空、航天、機(jī)械等多個(gè)領(lǐng)域。蓖麻籽中存在著毒性物質(zhì)，限制了蓖麻的綜合開發(fā)利用。蓖麻含有的毒性物質(zhì)中，以蓖麻毒蛋白毒性最強(qiáng)，它由A、B兩條鏈組成，其中A鏈為效應(yīng)鏈。利用分子生物學(xué)技術(shù)，抑制蓖麻蛋白A鏈基因的表達(dá)，為培育蓖麻無毒轉(zhuǎn)基因植株奠定基礎(chǔ)，對(duì)蓖麻無毒品種培育、提高蓖麻飼用價(jià)值及拓寬蓖麻綜合利用途徑有重要意義。 1.根據(jù)基因Genebank中發(fā)布的RT

2、A基因序列，分別設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，在兩端分別插入不同的酶切位點(diǎn)。降落PCR法擴(kuò)增蓖麻毒蛋白A鏈基因，純化RTA-S1，RTA-S2，RTA-AS1、RTA-AS2片段，連接克隆質(zhì)粒pGEM T-easy，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)菌落PCR及質(zhì)粒酶切鑒定正確的陽性克隆做序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果顯示，得到的基因片段與源序列高度同源，同源性分別為94％、94％、98％、98％。 2.將序列分析正確的陽性克隆提取質(zhì)粒，分別酶切回收RTA-