髓系細胞觸發(fā)受體-1天然配體的初步研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是指微生物入侵機體感染后所致的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱或體溫下降、白細胞增多或減少、心動過速、呼吸急促等癥狀，進一步發(fā)展可導致嚴重膿毒癥(severe sepsis)、膿毒性休克(septic shock)甚至多器官功能障礙綜合征(MODS)。膿毒癥的病理生理機制比較復雜，目前認為是由于機體免疫系統(tǒng)對侵入病原

2、體的過度的炎癥反應和凝血反應等導致機體組織器官損害，并引起循環(huán)紊亂及其他一系列的損害。其分子機制目前認為是感染后炎癥細胞活化產(chǎn)生多種促炎細胞因子，而這些促炎細胞因子又可導致炎癥細胞激活，兩者互為因果形成炎癥級聯(lián)反應并逐級放大，最終全身播散引起膿毒癥。
　　 髓系細胞觸發(fā)受體 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells，TREM)-1是由Bouchon等在2000年發(fā)現(xiàn)的一種跨膜

3、受體蛋白，為免疫球蛋白超家族成員，主要表達于中性粒細胞和單核細胞表面。膿毒癥時TREM-1表達明顯上調(diào)，而相關研究也表明作為膿毒癥炎癥信號轉(zhuǎn)導關鍵分子，TREM-1在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。TREM-1作用主要通過與其天然配體結合后激活TREM-1/DAP12信號通路，進而增強炎癥因子釋放、炎癥細胞浸潤和增強中性粒細胞的致炎作用。由于TREM-1信號通路在膿毒癥中有重要作用，目前TREM-1的天然配體尚不明，配體研究有助于闡明TR

4、EM-1分子通路機制，能為診治膿毒癥提出有效的分子診治策略。相關研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者送檢標本中金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌為常見的病原菌；而熱失活的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌孵育處理單核細胞和中性粒細胞后TREM-1和相應炎癥因子如TNF-α、IL-1β的表達均明顯上調(diào)，提示TREM-1配體可能存在這些細菌上。
　　 目的：本實驗通過測定人中性粒細胞和單核細胞經(jīng)熱失活的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和結核分枝桿菌三種細菌的菌體、

5、細胞壁和細胞壁組分進行處理后細胞TREM-1 mRNA水平變化和細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β濃度變化，研究各處理方法對TREM-1信號通路影響，進而確定TREM-1天然配體可能性質(zhì)。
　　 方法：取健康志愿者外周靜脈血，密度梯度離心法分離人外周血單核細胞和中性粒細胞并進行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和結核分枝桿菌標準菌株；高滲透壓誘導培養(yǎng)細胞壁缺陷的金黃色葡萄球菌L型和銅綠假單胞菌L型。離心對數(shù)期標準菌、金

6、黃色葡萄球菌L型和銅綠假單胞菌L型獲得菌體，經(jīng)熱滅活后分別將100μl濃度為1×109/ml金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、結核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌L型及銅綠假單胞菌L型加入中性粒細胞懸液和單核細胞懸液，置37℃，5％ CO2條件細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。玻璃珠破碎法破碎菌體，超聲提取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和結核分枝桿菌細胞壁，分別加入上述三種細胞壁于原代培養(yǎng)的中性粒細胞懸液和單核細胞懸液，置37℃，5％CO2條件細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24

7、h。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取細胞壁多糖，氯仿-甲醇法提取脂類，硫酸銨鹽析法提取細胞壁蛋白，加入三種細菌細胞壁組分于原代培養(yǎng)的中性粒細胞懸液和單核細胞懸液，置37℃，5％CO2條件培養(yǎng)24h。取孵育后各處理組中性粒細胞和單核細胞提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并以GAPDH為內(nèi)參基因，熒光定量PCR檢測TREM-1 mRNA水平，ELISA雙抗體夾心法檢測細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β濃度。
　　 結果：1.中性

8、粒細胞和單核細胞經(jīng)金黃色葡萄球菌菌體、銅綠假單胞菌菌體、金黃色葡萄球菌細胞壁和銅綠假單胞菌細胞壁處理后TREM-1 mRNA水平上調(diào)，細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β濃度明顯升高（P<0.05）；能與配體競爭性結合的LP17可以削弱此效應（P<0.05）。中性粒細胞和單核細胞經(jīng)結核分枝桿菌菌體、結核分枝桿菌細胞壁和結核分枝桿菌細胞壁成分處理后TREM-1 mRNA水平、細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β濃度與空白對照無明顯差異（P

9、>0.05）。
　　 2.中性粒細胞和單核細胞經(jīng)細菌細胞壁成分處理后，與空白組相比，金黃色葡萄球菌細胞壁多糖處理后中性粒細胞TREM-1 mRNA水平上調(diào)3.86±0.20倍，單核細胞TREM-1 mRNA水平上調(diào)5.15±0.56倍（P<0.05）；銅綠假單胞菌細胞壁多糖處理后中性粒細胞TREM-1 mRNA水平上調(diào)4.03±0.15倍，單核細胞TREM-1 mRNA水平上調(diào)7.22±0.73倍（P<0.05），細胞培養(yǎng)上清中

10、TNF-α和IL-1β濃度明顯升高，能競爭性結合配體的LP17可以削弱此效應（P<0.05）。中性粒細胞和單核細胞分別經(jīng)金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白、金黃色葡萄球菌細胞壁脂類、銅綠假單胞菌蛋白、銅綠假單胞菌脂類、結核分枝桿菌細胞壁蛋白、結核分枝桿菌細胞壁脂類和結核分枝桿菌細胞壁多糖處理后TREM-1 mRNA水平、細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β濃度與空白組相比均無明顯變化（P>0.05）。
　　 3.中性粒細胞和單核細胞經(jīng)上述