髓系抑制性細(xì)胞負(fù)性因子配體與HIV疾病進(jìn)展關(guān)系研究.pdf

1、目的:
　　HIV感染人體后，免疫系統(tǒng)針對(duì)病毒產(chǎn)生細(xì)胞毒等多種抗病毒免疫應(yīng)答，感染者可以短暫的控制病毒血癥，但是病毒仍然在復(fù)制，病毒血癥難以被完全控制。T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的組成部分，在對(duì)抗HIV中具有重要作用，但是大多數(shù)HIV慢性感染者T細(xì)胞出現(xiàn)功能耗竭和無(wú)能，而導(dǎo)致T細(xì)胞功能損傷的原因尚未完全闡明。
　　髓系抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)，是一群異源群體細(xì)胞，由骨

2、髓祖細(xì)胞和未成熟的骨髓細(xì)胞(IMCs)組成。大量研究顯示MDSC具有免疫抑制作用，這種抑制性作用與精氨酸酶（Arg-1）、一氧化氮合酶(iNOS)、活性氧(ROS)、過(guò)氧硝酸鹽有關(guān)。負(fù)性因子是免疫耗竭的標(biāo)志，在高度活化和功能耗竭的T淋巴細(xì)胞上大量表達(dá)，對(duì)免疫活化有抑制作用。PD-1、Tim-3是兩種比較重要的負(fù)性因子，PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后能夠負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能，抑制T細(xì)胞增殖，下調(diào)效應(yīng)因子IL-2、IFN-γ的產(chǎn)生;Tim

3、-3與配體Gal-9的結(jié)合可以抑制CD4+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-17等。在小鼠卵巢癌模型的研究顯示，MDSC高表達(dá)PD-L1和CD80，阻斷PD-L1和CD80后能夠抑制MDSC的功能，而PD-L1和CD80的這種抑制性作用是通過(guò)與Treg表面的PD-1和CTLA-4相互作用實(shí)現(xiàn)的。以往研究證實(shí)Tim-3通過(guò)直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和耗竭來(lái)抑制免疫應(yīng)答，但是近期的一些研究中發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)還能夠

4、通過(guò)擴(kuò)增MDSC間接性的抑制免疫應(yīng)答，而Tim-3的這種作用與MDSC表面Tim-3的配體Gal-9有關(guān)。
　　在HIV感染中關(guān)于MDSC的研究?jī)H限兩篇，關(guān)于MDSC的研究表型不一致，研究的人群也局限于慢性感染者，在HIV感染早期，MDSC的數(shù)量可能會(huì)決定疾病預(yù)后，對(duì)于HIV感染早期MDSC表達(dá)情況以及與疾病進(jìn)展的關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道，這群MDSC表面負(fù)性因子配體PD-L1和Gal-9的表達(dá)情況如何尚無(wú)報(bào)道。
　　本研究擬對(duì)不同感

5、染階段HIV感染者M(jìn)DSC進(jìn)行研究，明確急性期HIV感染者M(jìn)DSC的表達(dá)變化以及與疾病進(jìn)展的關(guān)系，并研究HIV感染者M(jìn)DSC表面PD-L1和Gal-9表達(dá)情況，探索MDSC抑制作用與PD-L1和Gal-9的關(guān)系。
　　方法:
　　1、研究對(duì)象
　　32例無(wú)癥狀HIV慢性感染者(CHI)、15例無(wú)癥狀HIV急性期感染者(PHI)均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診，感染途徑多為男男性接觸，CHI患者感染時(shí)間一年以上，

6、PHI患者感染時(shí)間180天以內(nèi)，在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均未接受HAART治療;10例健康對(duì)照為隨機(jī)抽取的HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康人(NC);8例腫瘤未治療患者。HIV及NC組年齡、性別經(jīng)檢驗(yàn)均無(wú)顯著性差異。
　　2、MDSC表型檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象每人抽取1.5ml全血，提取PBMC。提取的PBMC用PBS洗一遍后進(jìn)行表面染色。MDSC:CD14PE-Cy-7、CD11bAPC、HLA-DRAPC-Cy-7、CD33FITC

7、;活化:CD3PE-Cy-7、CD4APC-Cy-7、CD8Percp、CD38FITC、HLA-DRAPC;負(fù)性因子:CD3PE-Cy-7、CD4APC-Cy-7、CD8Percp、PD-1FITC、Tim-3PE。室溫避光染色20min。染色后用PBS洗一遍，上樣前每管補(bǔ)多聚甲醛150ul。流式檢測(cè)CD14-/+HLA-DR-/lowCD33+CD11b+細(xì)胞。
　　3、MDSC抑制功能檢測(cè)
　　30ml全血提取急性期H

8、IV感染者PBMC，20ml全血提取健康人PBMC，活細(xì)胞計(jì)數(shù)。磁珠負(fù)選健康人CD8+T細(xì)胞，染CFSE，流式分選HIV感染者M(jìn)DSC（表面染色CD14、CD11b、CD33、HLA-DR），分選后的MDSC與健康人CD8+T細(xì)胞以2:1比例孵育3天，進(jìn)行CD8+T細(xì)胞增殖檢測(cè)。孵育后的細(xì)胞取出后用PBS洗一遍，進(jìn)行表面染色(CD8)，4度避光染色30min。染色后用PBS洗一遍，上樣前每管補(bǔ)多聚甲醛150ul。流式檢測(cè)CD8+T細(xì)胞的

9、增殖情況。
　　4、MDSC表面PD-L1、Gal-9檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象每人抽取1.5ml全血，提取PBMC。提取的PBMC用PBS洗一遍，按流式管數(shù)目補(bǔ)PBS，然后每管加入100ul細(xì)胞懸液進(jìn)行表面染色，CD14PE-Cy-7、CD11bAPC、HLA-DRAPC-Cy-7、CD33FITC，PD-L1PE、Gal-9PE，室溫避光染色20min。染色后用PBS洗一遍，上樣前每管補(bǔ)多聚甲醛150ul。流式檢測(cè)HLA-DR-

10、/lowCD14-CD33+CD11bhigh上PD-L1和Gal-9的表達(dá)量。
　　5、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值及病毒載量檢測(cè)
　　CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值依據(jù)1997年美國(guó)CDC關(guān)于HIV感染者CD4+T細(xì)胞檢測(cè)指導(dǎo)方法，應(yīng)用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式細(xì)胞儀MULTISET軟件檢測(cè)。病毒載量采用Roche公司COBAS(@)AmpliPrep(@)/COBAS(@)TaqMan(@)System自動(dòng)載

11、量?jī)x上以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定病毒載量。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以MeanwithSEM表示，兩組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)兩組間的差異性，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，相關(guān)的兩組之間的比較用兩配對(duì)樣本檢驗(yàn)(Wilcoxon)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　一、HIV急性期感染者HLA-DR-/lowCD14

12、-CD33+CD11bhigh細(xì)胞表達(dá)增加
　　我們首先對(duì)髓系抑制性細(xì)胞的表型進(jìn)行研究，以CD14-和CD14+來(lái)區(qū)分單核細(xì)胞MDSC和粒細(xì)胞MDSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11b+有兩群細(xì)胞:HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11blow和HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh。HIV急性期感染者(p=0.03)、慢性感染者(p=0.02)和腫瘤患者(p=0.00

13、08)的HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均高于健康人(NC)，腫瘤患者高于急性期(p=0.003)和慢性期HIV感染者(p=0.01)，而HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11blow和HLA-DR-/lowCD14+CD33+CD11b在四組中無(wú)顯著性差異。
　　二、HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞能抑制CD8+T細(xì)胞增殖并且與疾病進(jìn)展有關(guān)

14、　　為了驗(yàn)證HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞是否是具有抑制功能，我們進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞能夠抑制CD8+T細(xì)胞增殖。我們進(jìn)一步分析髓系抑制性細(xì)胞與疾病進(jìn)展的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)總的HIV感染者（急性期和慢性期）HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與CD4+T細(xì)胞的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4，p=0.005)，與載量呈正相關(guān)(r=-0.67，p＜0.0001)，與CD4+T細(xì)

15、胞的活化水平（％CD4+CD38+HLA-DR+）呈正相關(guān)(r=0.48，p=0.01)，與CD8+T細(xì)胞的活化水平無(wú)相關(guān)性;慢性期感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與CD4+T細(xì)胞的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.41，p=0.02)，按CD4+T細(xì)胞大于和小于350cells/ul進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞大于350細(xì)胞/微升組HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞百分?jǐn)?shù)

16、有低于CD4+T細(xì)胞小于350細(xì)胞/微升組的趨勢(shì)(p=0.18)，而HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與載量呈正相關(guān)(r=0.7，p＜0.0001)，與CD4+T細(xì)胞的活化水平(％CD4+CD38+HLA-DR+)呈正相關(guān)(r=0.65，p=0.002)，與CD8+T細(xì)胞的活化水平無(wú)相關(guān)性;急性期HIV感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與CD4+T細(xì)胞的數(shù)量呈

17、負(fù)相關(guān)(r=-0.72，p=0.0026)，按CD4+T細(xì)胞大于和小于500細(xì)胞/微升進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞大于細(xì)胞/微升組HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞百分?jǐn)?shù)低于CD4+T細(xì)胞小于500細(xì)胞/微升組(p=0.0054)，并且HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與載量呈正相關(guān)(r=0.62，p=0.01)，與CD4+T細(xì)胞的活化水平(％CD4+CD38+HLA-D

18、R+)呈正相關(guān)(r=0.64，p=0.034)，與CD8+T細(xì)胞的活化水平(％CD8+CD38+HLA-DR+)有正相關(guān)的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　三、HIV感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞表面PD-L1和Gal-9表達(dá)增加
　　急性期HIV感染者(p=0.02)、慢性期HIV感染者(p＜0.0001)和腫瘤患者(p=0.0016)HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bh

19、igh細(xì)胞表面PD-L1百分?jǐn)?shù)高于健康人;慢性期HIV感染者(p=0.03)、腫瘤患者(p=0.026)HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞表面Gal-9百分?jǐn)?shù)高于健康人;總的HIV感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞表面PD-L1百分?jǐn)?shù)(r=-0.42，p=0.01)和Gal-9百分?jǐn)?shù)(r=-0.4，p=0.007)與CD4數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，與病毒載量有正相關(guān)的趨勢(shì)。慢性期HI

20、V感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞表面PD-L1百分?jǐn)?shù)(r=-0.44，p=0.037)和Gal-9百分?jǐn)?shù)(r=-0.38，p=0.03)與CD4+T細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，與病毒載量有正相關(guān)的趨勢(shì)。急性期HIV感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞表面PD-L1和Gal-9百分?jǐn)?shù)與CD4數(shù)量和病毒載量均無(wú)相關(guān)性。
　　四、慢性期HIV感染者HLA-DR-/lowCD

21、14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞表達(dá)量與CD4+T細(xì)胞表面TIM-3、PD-1表達(dá)有關(guān)
　　慢性期HIV感染者HLA-DR-/lowCD14-CD33+CD11bhigh細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與CD4+T細(xì)胞表面PD-1(r=0.52，p=0.02)和TIM-3(r=0.54，p=0.014)百分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞表面TIM-3和PD-1的百分?jǐn)?shù)無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論:
　　HIV急性期患者HLA-DR-/lowCD14