苦參堿衍生物M19對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的防治作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組累及胃腸道的慢性非特異性炎癥性疾病，包括克羅恩病(Crohn's disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)。IBD的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚，多數(shù)研究認(rèn)為與遺傳因素、感染因素、腸道免疫功能異常等相關(guān)。UC的病變主要累及直腸和結(jié)腸的粘膜層和粘膜下層，主要癥狀有腹痛、腹瀉、膿血便和里

2、急后重等，常反復(fù)發(fā)作。
　　 苦參堿是從中藥苦參中分離提取的一種生物堿，大量研究證實(shí)其具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗肝纖維化、免疫調(diào)節(jié)等作用。但天然提取的苦參堿藥物活性較低。我們的前期實(shí)驗(yàn)從苦參堿的眾多衍生物中篩選出活性較高的M19，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，M19抗炎活性較苦參堿提高了10倍，且M19具有較強(qiáng)的抗慢性肝損傷作用。
　　 葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)是一種由蔗糖合成的硫酸多糖體，

3、有大量研究報(bào)道由DSS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的病變從肛門側(cè)自下而上可侵及全段結(jié)腸，其病理改變及臨床表現(xiàn)都較接近人類UC，因而被廣泛應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)一類非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。細(xì)胞在各種外界因素的刺激下，可通過(guò)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑使MAPK通路

4、被磷酸化而激活，活化后的MAPK可通過(guò)磷酸化作用激活多種轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而引起相應(yīng)目的基因表達(dá)的增加。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在人體內(nèi)廣泛存在，參與細(xì)胞增生、分化、發(fā)育、凋亡以及炎癥等過(guò)程。主要的MAPK信號(hào)通路包括:c-Jun氨基末端激酶通路/應(yīng)激激活蛋白(c-Jun N-terminal kinase，JNK/stress activated proteinkinase, JNK/SAPK), p38MAPK通路(p38 mitogen a

5、ctivated protein, p38MAPK),細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶通路(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)。
　　 NF-κB是一種調(diào)節(jié)多種炎癥細(xì)胞因子、趨化因子表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各種組織中，可促進(jìn)與炎癥相關(guān)的多種基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與多種原因引起的組織損傷過(guò)程。免疫和炎癥反應(yīng)中大量基因的表達(dá)受到NF-κB調(diào)節(jié)的，NF-κB的持續(xù)激活與許多炎癥性

6、疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸炎等相關(guān)。p65是NF-κB的重要亞基，激活的NF-κB主要以p65轉(zhuǎn)位入核調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。
　　 本次課題的主要目的是探討苦參堿衍生物M19對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的防治作用和可能的機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立Balb/c小鼠DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，將80只健康Balb/c小鼠隨機(jī)分為8組:正常對(duì)照組、PBS對(duì)照組、DSS組、SASP(100mg/kg)組、苦參堿(30

7、mg/kg)組和M19(1mg/kg，10mg/kg，30mg/kg)組。正常對(duì)照組飲用蒸餾水，其余各組自由飲用2％ DSS6天，各治療組于給予DSS前一天起予相應(yīng)藥物灌胃，每天一次，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每天觀察記錄小鼠體重、稀便、便血情況，以評(píng)估疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)，處死小鼠后比較各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度變化，HE染色觀察結(jié)腸組織病理變化及評(píng)分，PAS染色觀察結(jié)腸上皮杯狀細(xì)胞變化，Realtime-PCR法檢測(cè)結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α表達(dá)情況

8、。
　　 2、體外實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)HT29細(xì)胞，分為以下5組:正常對(duì)照組、TNF-α（10ng/ml）組和M19（0.1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L）組。予M19預(yù)刺激4小時(shí)，除正常對(duì)照組外各組均予10ng/ml TNF-α刺激，TNF-α刺激4小時(shí)后提取各組細(xì)胞總RNA，Realtime-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞IL-1β、TNF-α表達(dá)情況。分組及預(yù)刺激方法同上，TNF-α刺激15分鐘后提取各組細(xì)胞總蛋白，Wes

9、tern-Blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞p38、ERK、JNK及p65激活情況，探討M19可能的作用機(jī)制。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、M19可顯著減低小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)。M19組平均結(jié)腸長(zhǎng)度縮短較模型組顯著減輕，較SASP組和苦參堿組亦明顯減輕。HE染色顯示M19可明顯減輕實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中的腸上皮破壞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，PAS染色顯示M19可顯著緩解結(jié)腸炎上皮中的杯狀細(xì)胞減少。
　　 2、Rea

10、l-time PCR檢測(cè)顯示苦參堿、SASP、M19均可抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中升高的IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)，且M19的抑制作用顯著優(yōu)于苦參堿和SASP。
　　 3、體外實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)M19預(yù)處理的HT-29細(xì)胞中IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)量較TNF-α刺激組顯著減低，其中M19高劑量組炎癥因子表達(dá)最低。M19可抑制TNF-α刺激HT-29細(xì)胞引起的MAPK通路p38、ERK、JNK的磷酸化和p65的磷酸化，