桔小實(shí)蠅幾丁質(zhì)和保幼激素合成與代謝中重要基因的研究.pdf

1、幾丁質(zhì)和保幼激素在昆蟲發(fā)育和變態(tài)過程中扮演著關(guān)鍵角色。幾丁質(zhì)是昆蟲表皮、氣管和中腸圍食膜的主要成分，昆蟲的生長發(fā)育依賴于體內(nèi)幾丁質(zhì)生物合成與代謝的精確控制;昆蟲體內(nèi)保幼激素的含量由保幼激素合成與代謝共同維持平衡，保幼激素直接影響昆蟲的變態(tài)和發(fā)育。幾丁質(zhì)和保幼激素的合成與代謝途徑成為昆蟲發(fā)育研究的熱點(diǎn)，也是探索害蟲控制新策略的重要途徑。桔小實(shí)蠅是一種重要的果蔬害蟲，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，寄主范圍廣，可以危害多達(dá)250種的水果和蔬菜。

2、桔小實(shí)蠅成蟲產(chǎn)卵于果實(shí)內(nèi)，主要以幼蟲潛居果瓤內(nèi)取食，造成果實(shí)腐爛和落果。目前對桔小實(shí)蠅的控制主要依賴于化學(xué)殺蟲劑，但是各地區(qū)相繼報(bào)道了桔小實(shí)蠅對多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗性，因此需要尋找新的途徑進(jìn)行持續(xù)防控。本學(xué)位論文以桔小實(shí)蠅為研究對象，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，對幾丁質(zhì)和保幼激素合成與代謝中重要基因的分子特性及功能開展了較為系統(tǒng)和深入的研究，主要結(jié)果如下:
　　1.桔小實(shí)蠅幾丁質(zhì)合成酶1基因克隆、mRNA表達(dá)特性及功能分析
　　采用RT

3、-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，克隆獲得了桔小實(shí)蠅幾丁質(zhì)合成酶1(Chitinsynthase1，CHS1)基因的全長序列，并發(fā)現(xiàn)該基因存在選擇性剪切現(xiàn)象，包括2個可變外顯子，分別命名為BdCHS1a和BdCHS1b。兩個基因的cDNA序列全長均為5552 bp，包含5'非編碼區(qū)域685 bp和3'非編碼區(qū)88 bp，開放閱讀框4776 bp，編碼1592個氨基酸殘基。兩個CHS1基因僅在編碼區(qū)(3784-3960 bp)內(nèi)的一個外顯子的核苷

4、酸序列存在差異，包含177 bp，編碼59個氨基酸殘基，且核苷酸水平上的一致性為65％。在桔小實(shí)蠅生長發(fā)育過程中，BdCHS1和BdCHS1a在幼蟲-蛹和蛹-成蟲的轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)量明顯高于其他時期，而BdCHS1b在蛹-成蟲轉(zhuǎn)化過程中以及蛹中期表達(dá)量較高。BdCHS1a主要在表皮中表達(dá)，BdCHS1b主要在氣管中表達(dá)，而在脂肪體、中腸和馬氏管的表達(dá)量較低。20-Hydroxyecdyson(20E)能夠誘導(dǎo)BdCHS1及其兩個可變外顯子

5、的表達(dá)上調(diào)。其中，BdCHS1和BdCHS1a在處理8h后表達(dá)量顯著升高，而BdCHS1b在處理1h后表達(dá)量明顯升高，說明BdCHS1b能夠更加迅速對20E作出響應(yīng)。除蟲脲處理桔小實(shí)蠅幼蟲后，BdCHS1及其兩個可變外顯子的表達(dá)量明顯高于對照，推測可能是由于幾丁質(zhì)合成受阻后基因表達(dá)水平的代償性增加所造成的，幾丁質(zhì)合成酶可能是除蟲脲作用的靶標(biāo)之一。桔小實(shí)蠅3齡幼蟲注射BdCHS1及其兩個可變外顯子的dsRNA后，目的基因的表達(dá)量明顯降低，

6、試蟲在生長發(fā)育過程中出現(xiàn)了表型異常的現(xiàn)象，并導(dǎo)致部分蟲體死亡。其中，干擾BdCHS1和BdCHS1a后試蟲表皮出現(xiàn)黑化、皺縮進(jìn)而死亡等現(xiàn)象，而干擾BdCHS1b后卻未出現(xiàn)表型變化。這些結(jié)果說明BdCHS1在桔小實(shí)蠅幼蟲-蛹轉(zhuǎn)化過程中起主要作用，BdCHS1基因的表達(dá)可以被20E調(diào)節(jié)。
　　2.桔小實(shí)蠅幾丁質(zhì)酶基因克隆、mRNA表達(dá)特性及功能分析
　　克隆獲得了桔小實(shí)蠅2條幾丁質(zhì)酶基因的cDNA全長序列，分別命名為BdCht2

7、和BdCht5。BdCht2開放閱讀框1449 bp，編碼483個氨基酸，5'非編碼區(qū)和3'非編碼區(qū)的序列長度分別為126 bp和296bp。BdCht2基因組具有4個外顯子和3個內(nèi)含子。BdCht5開放閱讀框1785 bp，編碼595個氨基酸。預(yù)測BdCht2和BdCht5蛋白的分子量分別為54.3 kDa和67.5 kDa，等電點(diǎn)分別為5.97和5.70。根據(jù)所獲得基因的氨基酸序列信息與其他昆蟲幾丁質(zhì)酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)這兩個幾

8、丁質(zhì)酶基因分別屬于GroupⅦ和GroupⅠ;通過對其推導(dǎo)的氨基酸進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)功能區(qū)域的分布特征與上述的GroupⅦ和GroupⅠ幾丁質(zhì)酶相同。另外，還克隆獲得了BdCht2基因的5'端側(cè)翼區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
　　qPCR結(jié)果表明，BdCht2和BdCht5的表達(dá)量均在幼蟲-蛹和蛹-成蟲的轉(zhuǎn)化期明顯高于其他時期，可能與它們主要在桔小實(shí)蠅變態(tài)發(fā)育中發(fā)揮作用有關(guān)。BdCht2和BdCht5分別在表皮和氣管表達(dá)量較高，中腸

9、和其他組織表達(dá)量相對較低。20E均能不同程度地誘導(dǎo)2個幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)上調(diào)，與對照相比分別在處理后8h和12 h出現(xiàn)明顯的上調(diào)，并具有一定的劑量效應(yīng)。桔小實(shí)蠅3齡幼蟲進(jìn)行饑餓處理，可以提前化蛹，導(dǎo)致提前變態(tài)發(fā)育;同時饑餓也能誘導(dǎo)2個幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)上調(diào)，重新飼喂后其表達(dá)量下降。向桔小實(shí)蠅3齡幼蟲體內(nèi)注射BdCht2和BdCht5基因的dsRNA進(jìn)行RNAi，其中BdCht5的沉默效率較高，而BdCht2的RNAi敏感度較低且基因豐度下

10、降不明顯，但均沒有觀察到試蟲表型有異?，F(xiàn)象。
　　3.桔小實(shí)蠅保幼激素合成通路中重要基因的克隆及mRNA表達(dá)特性分析
　　克隆獲得了6個桔小實(shí)蠅保幼激素合成酶基因，其中包括參與JH合成上游甲羥戊酸(Mevalonic acid，MVA)途徑的BdHMGS、BdHMGR、BdIPPI、BdFPS等4個基因，主要負(fù)責(zé)將乙酰輔酶A催化生成異戊烯醇焦磷酸;以及參與JH合成下游途徑的BdSDR和BdJHAMT-like2個基因。通過序

11、列分析明確了6個基因的開放閱讀框，并推導(dǎo)了所編碼的氨基酸序列，并發(fā)現(xiàn)其具有高度保守的結(jié)構(gòu)域。
　　利用qPCR技術(shù)分析了保幼激素合成通路中重要基因在桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段和組織的mRNA表達(dá)特性，結(jié)果表明，BdFPS和BdSDR基因在3齡幼蟲期高表達(dá)，其它基因表達(dá)較低或不表達(dá);除BdSDR外，其他基因均在蛹期高表達(dá);多數(shù)基因在雌蟲的表達(dá)量明顯高于雄蟲，具有明顯的性別差異。所有JH合成酶基因在桔小實(shí)蠅成蟲的頭部和脂肪體特異性表達(dá)，這可

12、能與咽側(cè)體主要位于頭部，而脂肪體在成蟲性成熟過程中發(fā)揮重要作用有關(guān)。解剖桔小實(shí)蠅成蟲脂肪體進(jìn)行體外組織培養(yǎng)，加入JH類似物后，大多數(shù)JH合成酶基因的表達(dá)受到明顯的抑制，而20E在一定的程度上也對這些基因表現(xiàn)為抑制作用，說明保幼激素合成酶基因受外源激素的反饋調(diào)節(jié)。另外，與正常飼喂相比，BdHMGS、BdIPPI和BdJHAMT-like基因在饑餓48 h后其表達(dá)量明顯降低，合成JH的速率明顯變慢，導(dǎo)致其體內(nèi)合成JH的量大幅度減少，桔小實(shí)蠅

13、幼蟲發(fā)生提前變態(tài)而形成蛹。另外，饑餓可以誘導(dǎo)BdHMGR基因的表達(dá)上調(diào)，而BdFPS和BdSDR基因的表達(dá)沒有顯著的變化。綜上所述，推測桔小實(shí)蠅JH合成通路中這些基因應(yīng)對激素和饑餓脅迫的調(diào)控模式存在差異。
　　4.桔小實(shí)蠅3-羥甲基戊二酰輔酶A-還原酶基因(BdHMGR)的功能分析
　　利用RNAi技術(shù)進(jìn)一步研究了桔小實(shí)蠅BdHMGR基因的功能。結(jié)果表明，對5日齡雌成蟲注射BdHMGR基因dsRNA后，與注射dsGFP后相比

14、，目的基因的表達(dá)量顯著降低，且卵巢中BdVg2表達(dá)量明顯降低，卵巢發(fā)育不健全，以及直徑減小而導(dǎo)致產(chǎn)卵量顯著降低。研究結(jié)果說明BdHMGR可以作為一個潛在的靶標(biāo)來開發(fā)新的害蟲防控手段，以及基于RNAi技術(shù)的桔小實(shí)蠅及其它害蟲的有效控制。
　　5.保幼激素代謝酶基因的克隆及mRNA表達(dá)特性分析
　　昆蟲體內(nèi)保幼激素的代謝由保幼激素酯酶、保幼激素環(huán)氧水解酶和保幼激素二醇激酶等3種酶共同催化完成。本研究克隆獲得了桔小實(shí)蠅4個保幼激素

15、代謝酶相關(guān)基因的cDNA全長序列，包括BdJHE、BdJHEH2、BdJHEH3和BdJHDK。通過序列分析明確了4個基因的開放閱讀框，推導(dǎo)了其編碼的氨基酸序列，并發(fā)現(xiàn)其均具有高度保守的結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析表明3種保幼激素代謝酶在進(jìn)化中均與雙翅目昆蟲相關(guān)基因的親緣關(guān)系最近。
　　BdJHE、BdJHEH2和BdJHDK均在幼蟲-蛹的轉(zhuǎn)化過程中高表達(dá)，可能與這3個基因在幼蟲化蛹的過程中發(fā)揮作用相關(guān)。BdJHEH3在3齡幼蟲早期有較高

16、的表達(dá)，而在變態(tài)過程中表達(dá)較低，推測其可能不是專一性降解JH的環(huán)氧水解酶。3種JH代謝酶在成蟲7、10日齡的表達(dá)量較高，且雌、雄蟲之間存在明顯的差異，雌蟲BdJHE和BdJHEH2的表達(dá)量明顯高于雄蟲，而BdJHDK則為雄蟲高于雌蟲。桔小實(shí)蠅脂肪體的BdJHE和BdJHEH2 mRNA表達(dá)量明顯高于其他組織，而BdJHEH3和BdJHDK分別在中腸和馬氏管的表達(dá)量高于其他組織。3齡幼蟲體內(nèi)注射20E后，除BdJHE外，其余3個JH代謝酶

17、基因的表達(dá)量均出現(xiàn)明顯的變化。與對照相比，BdJHEH2和BdJHEH3在處理1h后表達(dá)量明顯上升，而BdJHDK基因表達(dá)量卻明顯下降。注射4h和8h后，BdJHEH2和BdJHEH3的表達(dá)量也明顯上升，而BdJHDK在12h后表達(dá)量也明顯上升。說明3種保幼激素代謝酶的作用方式不同，主要由JHEH和JHDK作出回應(yīng)并具有誘導(dǎo)效應(yīng)。進(jìn)一步分析了JH代謝酶應(yīng)對饑餓脅迫的表達(dá)變化，結(jié)果表明BdJHE和BdJHDK的表達(dá)量明顯上升，而恢復(fù)喂食后

18、其基因表達(dá)量又下降;BdJHEH2和BdJHEH3的表達(dá)量卻下降，重新飼喂后表達(dá)量與正常取食的一致。不同保幼激素代謝酶基因表達(dá)的變化表明其在幼蟲生長發(fā)育過程中具有不同的作用。
　　綜上所述，本研究基于桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過克隆獲得了13條桔小實(shí)蠅幾丁質(zhì)和保幼激素合成與代謝中重要基因的cDNA全長序列，并進(jìn)行了分子特性分析。采用qPCR技術(shù)系統(tǒng)地分析了13個基因在桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段、不同組織部位的表達(dá)特性，以及受激素、饑餓等因子