S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因工程菌的構(gòu)建及活性分析.pdf

1、S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)在真核細(xì)胞中具有重要的甲基循環(huán)代謝調(diào)節(jié)作用，是存在于生物細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)甲基反應(yīng)的一種水解酶，此水解酶廣泛存在于真核細(xì)胞如：人類、植物、真菌中。SAHH其主要的功能是催化S-腺苷高半胱氨酸(SAH)水解生成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)的可逆反應(yīng)。研究表明人體內(nèi) S-腺苷高半胱氨酸水解酶水平的高低可能影響冠心病和阿爾茨海默癥即老年癡呆病的發(fā)病概率。
　　為了更好的研究該酶，我們通過基因克隆技術(shù)將

2、人源表達(dá)SAHH的基因整合到畢赤酵母菌基因組上，成功構(gòu)建真核表達(dá)體系，再利用畢赤酵母菌表達(dá)該目的蛋白SAHH。具體的實(shí)驗(yàn)方案如下：首先，我們從 GenBank中查找到編碼人源的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，在此目的基因前后設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)和重組標(biāo)簽 His-tag。通過全基因合成技術(shù)合成擁有完整編碼框的 S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，構(gòu)建pPIC9K-sahh表達(dá)載體。然后，利用同尾酶 Bgl II酶切克隆載體，通過電轉(zhuǎn)化使其整合到畢赤酵母

3、菌 GS115的基因組中，用遺傳霉素 G418篩選出高拷貝轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子通過 MD和 MM平板鑒定其表型為 MutS型。經(jīng)菌體 PCR驗(yàn)證后，將篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子用1％甲醇誘導(dǎo)，使其分泌 SAHH蛋白，之后我們利用冷凍干燥器將產(chǎn)物濃縮，利用0.22μm的濾膜過濾雜質(zhì)和晶體。最后，我們將濃縮后的液體通過 Ni-NTA親和層析對重組 SAHH蛋白進(jìn)行純化。此方法具有篩選方便、蛋白產(chǎn)物分泌表達(dá)穩(wěn)定和易于純化等優(yōu)點(diǎn)。人源 sahh基因包含129

4、9個堿基對，其編碼432個氨基酸，因此理論上此水解酶的相對分子量約為47.5 kDa，通過 SDS-PAGE得出發(fā)酵產(chǎn)物的條帶大小約為48 kDa。由于SAH被 SAHH一步水解為高半胱氨酸和腺苷，而高半胱氨酸可直接用 Ellman試劑直接定量測定，在412 nm下吸光度隨著產(chǎn)物的升高而升高，我們測得濃縮后的 SAHH蛋白酶活為626.6 IU，而經(jīng)過 Ni-NTA親和層析純化后的 SAHH蛋白酶活為1106.8 IU。而對照組即 sa

5、hh基因沒有整合到畢赤酵母菌 GS115基因組上的菌體通過此方法發(fā)酵得到的產(chǎn)物，測其酶活性約為1.33 IU，因此對于畢赤酵母菌 GS115本身的發(fā)酵產(chǎn)物對本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可以忽略不計(jì)。同時我們通過查閱文獻(xiàn)獲知有些研究通過對表達(dá)體系的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化后酶活可達(dá)到1600 IU相比我們所得的酶活較高，但是我相信我們在之后的對表達(dá)體系的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化后一定比1600 IU高。
　　結(jié)論：此研究中我們成功構(gòu)建畢赤酵母菌真核表達(dá)體系，同