釩、鋅配合物選擇性抑制PTP1B及其細(xì)胞效應(yīng)研究.pdf

1、蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）是生物體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用的一類酶，它能夠特異性去除蛋白酪氨酸殘基上的磷酸基團(tuán)，從而廣泛影響細(xì)胞生長、分化、遷移、凋亡和免疫應(yīng)答等過程。蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)和純化的PTP酶，它通過對(duì)胰島素受體及其底物的酪氨酸殘基去磷酸化，從而對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程進(jìn)行負(fù)調(diào)控。研究表明敲除PTP1B基因的小鼠對(duì)胰島素的敏感性和葡萄糖的耐受性都明顯增強(qiáng)并且正常生長。目前PTP1B被公認(rèn)為是

2、研發(fā)治療Ⅱ型糖尿病藥物的作用靶點(diǎn)。
　　釩配合物具有類胰島素的作用，并且已經(jīng)在糖尿病的治療中表現(xiàn)出了一定的效果。研究表明釩配合物的類胰島素作用與其對(duì)PTP1B的抑制有關(guān)?；阝C配合物VIVO(nbbb)(H2O)2(1)和VIVO(bpmp)2(3)能夠高效且選擇性抑制體外重組PTP1B的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1]，本論文進(jìn)一步研究了釩配合物1和3對(duì)細(xì)胞內(nèi)PTP1B的選擇性抑制作用及其對(duì)細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的影響，測(cè)定了細(xì)胞中釩配合物的含量，并

3、初步探究了釩配合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑。
　　鋅是生物體內(nèi)僅次于鐵、含量第二豐富的微量金屬元素，具有胰島素樣活性。鋅配合物也可能是有效的PTP1B抑制劑。本文研究了五種新型鋅配合物對(duì)PTP1B的選擇性抑制作用。
　　論文主要工作和研究結(jié)果如下：
　　1、運(yùn)用蛋白免疫印跡法檢測(cè)了釩配合物1和3作用于人乳腺癌細(xì)胞(MCF7)和肝癌細(xì)胞(HepG2)后PTP1B底物磷酸化水平的變化，進(jìn)而探究釩配合物對(duì)PTP1B的抑制作用。結(jié)果

4、表明釩配合物1和3能有效地抑制細(xì)胞內(nèi)PTP1B的活性，其中釩配合物1抑制PTP1B的選擇性較好，這與體外酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　2、運(yùn)用MTT比色法檢測(cè)釩配合物1和3在抑制細(xì)胞內(nèi)PTP1B活性的同時(shí)對(duì)細(xì)胞活力造成的影響。結(jié)果表明配合物1和3作用于兩種細(xì)胞后均會(huì)使細(xì)胞存活率減少，并且與時(shí)間和濃度呈依賴關(guān)系。與配合物3相比，釩配合物1對(duì)細(xì)胞活性影響較小，有較低的細(xì)胞毒性，尤其是在MCF7細(xì)胞中細(xì)胞存活率高達(dá)86％。
　　運(yùn)用流

5、式細(xì)胞術(shù)和Annexin V-PI雙染法研究了釩配合物1和3對(duì)MCF7細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明釩配合物1和3能誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞凋亡，并且配合物影響細(xì)胞活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈線性關(guān)系，表明這兩個(gè)釩配合物是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而影響細(xì)胞活性的，而不是直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死。
　　釩配合物1和3作用于不同的細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞內(nèi)磷酸化、細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡產(chǎn)生了不同的影響，這可能與釩配合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的含量有關(guān)。本論文通過ICP-MS測(cè)定了釩配合物

6、作用后，MCF7和HepG2細(xì)胞內(nèi)釩的含量。結(jié)果表明釩配合物1和3都能很好的進(jìn)入細(xì)胞，有較好的脂溶性和細(xì)胞通透性。其中配合物1由于空間結(jié)構(gòu)較小，比配合物3更容易進(jìn)入細(xì)胞。此外，盡管VOSO4在細(xì)胞內(nèi)也能夠有效抑制PTP1B的活性，但是VOSO4作為一種無機(jī)鹽，它不能很好的穿透細(xì)胞膜，生物利用度比較差。
　　3、由于PTPs能廣泛影響細(xì)胞的生長和凋亡過程，所以釩配合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與其對(duì)PTPs的抑制作用有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道部分金屬配合

7、物作為蛋白酶體抑制劑，能夠通過抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體的活性從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本論文通過研究釩配合物1和3對(duì)蛋白酶體活性的影響，初步探究了釩配合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑。結(jié)果表明釩配合物1和3作用于MCF7細(xì)胞后促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體的活性，說明釩配合物并不是通過抑制蛋白酶體的活性，而可能是通過抑制PTPs的活性從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。配合物1和3對(duì)未經(jīng)處理的MCF7細(xì)胞提取物中蛋白酶體的活性基本沒有影響，說明釩配合物在細(xì)胞內(nèi)并不是直接作用于蛋白酶體增

8、強(qiáng)其活性的，而可能是由于釩配合物抑制PTPs的活性增強(qiáng)了其相關(guān)底物的磷酸化水平，從而影響蛋白酶體的上游靶標(biāo)，誘導(dǎo)了蛋白酶體表達(dá)，使其活性增強(qiáng)。
　　釩配合物1在細(xì)胞內(nèi)能選擇性抑制PTP1B的活性，有較低的細(xì)胞毒性、良好的細(xì)胞通透性，有望成為新型的II型糖尿病治療藥物。
　　4、以多苯并咪唑?yàn)榕潴w，合成了鋅配合物6-10，并研究了其對(duì)PTP1B的選擇性抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這五種鋅配合物都能有效抑制PTP1B的活性，但是對(duì)PT

9、P-MEG2和SHP-1抑制較弱，幾乎不抑制SHP-2。TCPTP是與PTP1B高度同源的一種酶，配合物7和9對(duì)TCPTP的抑制作用明顯弱于配合物6、8、10，因而7和9對(duì)PTP1B表現(xiàn)出較好的選擇性。酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明7和9對(duì)PTP1B和TCPTP的抑制類型分別為競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性，推測(cè)配合物的選擇性可能與其抑制方式有關(guān)。熒光滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物7和9與PTP1B的結(jié)合能力強(qiáng)于TCPTP，這與它們對(duì)這兩種酶的抑制能力一致。繼續(xù)深入