人PTP1B真核載體在COS-7細胞中的表達及其體外抑制劑實驗.pdf

1、目的：克隆人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因及構(gòu)建真核表達重組體pcDNA3.1-hPTP1B，轉(zhuǎn)染至猴腎成纖維細胞系(COS-7)，表達的重組融合蛋白用親和層析法純化，初步進行了酶活性及抑制劑的實驗。 方法：通過設(shè)計5'端引物和3'端引物(分別含BamH，EcoR I酶切位點)，取2型糖尿病人(BMI>28kg.m-2)抗凝外周血，淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。提取總RNA，以O(shè)ligo dT為引物，合成出cDNA第一鏈。

2、以RT產(chǎn)物為模板，PCR擴增出PTP1B插入片段。酶切后定向?qū)雙cDNA3.1/myc-His-B多克隆位點，構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1-hPTP1B，轉(zhuǎn)染COS-7細胞，G-418篩選2周后取細胞裂解上清液經(jīng)Ni2+親和層析柱純化后，利用PTP水解特異性底物4-硝基苯基磷酸二鈉鹽(pNPP-Na2-Na2)的磷酸基團而產(chǎn)生顏色反應(yīng)來測定PTP1B酶的活性。主要測定：1.PTP1B活性與PTP1B濃度的關(guān)系；2.PTP1B活性與

3、底物pNPP-Na2濃度的關(guān)系；3.PTP1B活性與反應(yīng)溫度的關(guān)系；4.特異性抑制劑釩酸鈉(Na3VO4)抑制作用的濃度依賴關(guān)系及抑制類型的研究；5.常用胰島素治療藥物吡格列酮和二甲雙胍對PTP1B酶有無抑制作用的試探性研究；6.中藥老鷹茶對PTP1B酶的抑制性作用和濃度依賴關(guān)系。 結(jié)果：從2型糖尿病患者外周血中擴增得到1301bp PTP1B cDNA全長序列，經(jīng)雙酶切鑒定及測序分析，表明hPTP1B 已克隆到pcDNA3.1

4、/myc-His-B中。RT-PCR和免疫印跡表明轉(zhuǎn)染成功。抑制劑研究表明：1.rhPTP1B的活性隨酶濃度底物濃度增加而增加；2.在35℃左右，rhPTP1B的活性最大；3.釩酸鈉對PTP1B的抑制作用呈濃度依賴性增強，PTP1B酶活性隨釩酸鈉濃度增加而減少，雙倒數(shù)作圖顯示，釩酸鈉的作用機制可能為非競爭性抑制作用：4.常用治療糖尿病藥物二甲雙胍和吡格列酮對PTP1B酶并無明顯抑制作用，而老鷹茶的總黃酮粗提物(TFIC)對PTP1B有明