以木瓜蛋白酶為模型蛋白的親和色譜新介質(zhì)的制備及其吸附機(jī)理研究.pdf

1、親和色譜是一種利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力,選擇性地分離目標(biāo)分離物的現(xiàn)代分離純化技術(shù)。隨著這些年高效親和色譜技術(shù)的發(fā)展與成熟,使其在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程、基因工程等領(lǐng)域的應(yīng)用受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。然而由于親和配基價(jià)格昂貴、色譜操作壓大、處理量小等缺點(diǎn),使之很難在低成本,高效率的前提下發(fā)揮更大的作用,因此尋找具有親和配基相似活性的小分子和發(fā)展新型廉價(jià)的載體材料成為亟待解決的問(wèn)題。
　　目前,通過(guò)

2、組合篩選技術(shù)篩選親和配基和改良現(xiàn)有的色譜載體的方法占有主導(dǎo)地位,但是組合篩選技術(shù)很大程度上增加了篩選配基的工作量和成本,改良現(xiàn)有載體更是無(wú)法從根本上解決操作繁瑣,處理量小等缺陷。通過(guò)選擇價(jià)格低廉的染料或金屬離子為親和配基制備新型色譜介質(zhì),以及用生物技術(shù)淘洗親和配基的方法可以很好地解決上述兩個(gè)難題,而且可以在保證不降低目標(biāo)分離物生物活性的前提下,快速、高效地進(jìn)行分離純化操作。在此方面的研究中,選擇染料親和色譜和仿生配基親和色譜,發(fā)展新型載

3、體等課題引起了廣大研究學(xué)者的關(guān)注。
　　本文以木瓜蛋白酶為模型蛋白,分別通過(guò)化學(xué)法和生物法制備了兩種能夠低成本,高效率地分離純化模型蛋白的親和色譜新介質(zhì),即通過(guò)化學(xué)法制備了利用膜色譜的低壓降,染料配基的低成本的染料親和膜色譜介質(zhì);通過(guò)生物法制備了利用噬菌體展示技術(shù)的高效率,噬菌體交聯(lián)法的低損耗的交聯(lián)噬菌體七肽親和吸附介質(zhì)(CAPOP)。分別考察了這兩種親和色譜介質(zhì)對(duì)模型蛋白的吸附性能,利用親和吸附模型闡述了兩種親和色譜介質(zhì)對(duì)模型蛋

4、白的吸附機(jī)理,并最終評(píng)價(jià)了對(duì)模型蛋白分離純化的有效性。
　　本文首先以機(jī)械強(qiáng)度好的尼龍膜為載體,利用化學(xué)法選擇1M HCl酸水解法、甲醛活化法、殼聚糖改性法,鍵合染料后制備出染料Reactive Red120親和膜色譜介質(zhì)。通過(guò)掃描電鏡、紫外光譜、紅外光譜和元素分析對(duì)染料親和膜進(jìn)行定性定量分析,確定染料親和膜殼聚糖含量為118.5+7.5mg/g,染料含量為163.4+10.3μmol/g,孔徑大小均勻(0.5-3.0μm),比表

5、面積大,利于蛋白質(zhì)分子自由通過(guò),是一種較為理想的分離純化介質(zhì)。以木瓜蛋白酶為模型蛋白,采用靜態(tài)吸附法和動(dòng)態(tài)脫附法研究染料親和膜色譜介質(zhì)的蛋白質(zhì)吸附性能。
　　靜態(tài)吸附法考察了配基供給量、緩沖液pH值、緩沖液鈉離子強(qiáng)度、吸附溫度和吸附時(shí)間等對(duì)木瓜蛋白酶吸附量的影響。在吸附條件為:染料配基濃度10.0mg/mL、緩沖液pH8.5、鈉離子強(qiáng)度為0M、吸附溫度為37℃、吸附3h時(shí)最大靜態(tài)吸附量達(dá)到37.0mg/g。動(dòng)態(tài)脫附法考察了洗脫液、

6、洗脫液pH、洗脫液鈉離子強(qiáng)度和洗脫速度等對(duì)木瓜蛋白酶脫附量的影響。在動(dòng)態(tài)脫附條件為NaCl洗脫液pH6.0,鈉離子強(qiáng)度為1.0M,洗脫速度為1mL/min地洗脫下,達(dá)到最大的動(dòng)態(tài)脫附效果,純化后的酶活力達(dá)到1035.53U/mg,純化倍數(shù)約為20倍。
　　采用吸附等溫模型、吸附動(dòng)力學(xué)模型、吸附熱力學(xué)模型和計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)闡述染料親和膜對(duì)模型蛋白木瓜蛋白酶的吸附機(jī)理。以Langmuir吸附模型和Freundlich吸附模型考察染料親和

7、膜的蛋白質(zhì)吸附行為。研究發(fā)現(xiàn)Freundlich吸附模型可以較好地解釋染料親和膜的吸附行為,證實(shí)親和膜對(duì)木瓜蛋白酶的吸附是不均勻立體結(jié)構(gòu)的多分子層吸附模型。吸附動(dòng)力學(xué)模型分別用準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附模型、準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附模型、粒子內(nèi)擴(kuò)散吸附模型以及Elovich動(dòng)力學(xué)吸附模型考察染料親和膜的吸附行為。
　　研究發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附模型可以較好解釋該吸附行為,證實(shí)染料親和膜表面染料配基的活性位點(diǎn)越多,吸附能力就越強(qiáng),一旦染料配基的活性位點(diǎn)

8、覆蓋率變大,可供共價(jià)結(jié)合的位點(diǎn)減少,吸附能力下降。吸附熱力學(xué)研究結(jié)果為:焓變值ΔH0、熵變值ΔS0、吉布斯自由能ΔG0分別為18.52kJ/mol,0.077kJ/(mol K)和-4.43kJ/mol(298K)o焓變值ΔH0為18.52kJ/mol表明該吸附過(guò)程為吸熱反應(yīng),溫度的增加有利于吸附行為的發(fā)生,吸附作用力包括化學(xué)作用和物理作用。熵變值ΔS0為0.077kJ/(mol K)表明吸附過(guò)程是一個(gè)染料配基表面先脫附水分子,再吸附蛋

9、白分子的循環(huán)過(guò)程,即“溶劑置換作用”,同時(shí)證實(shí)整個(gè)體系的吸附過(guò)程是混亂度增加的吸熱過(guò)程。吉布斯自由能AG為-4.43kJ/mol(298K)不僅證明了吸附行為是自發(fā)的,還證實(shí)物理作用與化學(xué)作用同樣存在于該吸附行為中,并發(fā)揮主要作用。采用Maestro9.0軟件對(duì)染料配基和木瓜蛋白酶進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn),結(jié)果證實(shí)吸附行為不僅包含物理吸附(疏水作用),還包括化學(xué)偶聯(lián)作用(氫鍵)。
　　染料Reactive Red120親和膜初步

10、應(yīng)用于木瓜蛋白酶的分離純化。通過(guò)上樣,分離,洗滌,洗脫四個(gè)步驟,收集酶活最高的一組組分,冷凍干燥后經(jīng)比酶活計(jì)算和FPLC表征,得到純化倍數(shù)為粗酶溶液22.60倍的木瓜蛋白酶粉,證實(shí)所制備的染料Reactive Red120親和膜能有效的用于木瓜蛋白酶的富集和分離,能滿足皮革、飼料等領(lǐng)域?qū)χ械燃兌鹊哪竟系鞍酌感枨蟆?br>　　論文同時(shí)以木瓜蛋白酶為模型,通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選的七肽(Ile-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe)

11、為配基,以戊二醛為交聯(lián)劑,以交聯(lián)噬菌體為載體,利用生物法制備出交聯(lián)噬菌體七肽親和吸附介質(zhì)(CAPOP)。通過(guò)透射電鏡、動(dòng)態(tài)光散射儀、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)對(duì)CAPOP進(jìn)行定性分析,確定七肽配基的ELISAO0492值為1.9,證實(shí)對(duì)木瓜蛋白酶具有親和作用,交聯(lián)噬菌體團(tuán)聚物的粒徑為5-6μm,是單個(gè)噬菌體粒徑的10倍左右,證實(shí)交聯(lián)成功。該介質(zhì)具備特異性吸附高,價(jià)格低廉,制備簡(jiǎn)易的優(yōu)點(diǎn)。采用靜態(tài)吸附法、響應(yīng)面優(yōu)化法和動(dòng)態(tài)脫附法研究CAPOP的蛋白

12、吸附性能。靜態(tài)吸附法主要考察了緩沖液pH值、緩沖液鈉離子強(qiáng)度、吸附溫度和吸附時(shí)間等對(duì)木瓜蛋白酶吸附量的影響。在吸附條件為緩沖液pH7.0,鈉離子強(qiáng)度為0M,吸附溫度為25℃,吸附2h時(shí)最大靜態(tài)吸附量達(dá)到50mg/g。采用響應(yīng)面法分析了吸附過(guò)程中多種因素共作用對(duì)木瓜蛋白酶吸附量的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)不同因素的共作用對(duì)吸附量有顯著影響,得到回歸方程并建立優(yōu)化條件:噬菌體展示配基含量為1011PFU/mL,pH值為6.9,溫度為32℃,木瓜蛋白酶粗

13、酶溶液濃度為7.51mg/mL,木瓜蛋白酶的吸附量最高,為55.4229mg/g。動(dòng)態(tài)脫附法考察了洗脫液,洗脫液pH、洗脫液鈉離子強(qiáng)度和洗脫速度對(duì)木瓜蛋白酶吸附量的影響。在動(dòng)態(tài)脫附條件為pH9.0,鈉離子強(qiáng)度為1.0M,洗脫速度為1.0mL/min的NaSCN溶液的洗脫下,達(dá)到最大的動(dòng)態(tài)脫附效果,純化倍數(shù)達(dá)200倍左右,純化后的酶活力達(dá)到4647.73U/mg,基本與商品酶酶活持平。采用吸附等溫線模型,吸附動(dòng)力學(xué)模型,吸附熱力學(xué)模型和計(jì)

14、算機(jī)模擬技術(shù)探討交聯(lián)噬菌體對(duì)木瓜蛋白酶的吸附機(jī)理。分別以Langmuir吸附模型和Freundlich吸附模型考察CAPOP的吸附行為。研究發(fā)現(xiàn)Freundlich吸附模型可以較好地解釋CAPOP的吸附行為,證實(shí)CAPOP對(duì)木瓜蛋白酶的吸附是不均勻立體結(jié)構(gòu)的多分子層吸附模型,這與交聯(lián)噬菌體的立體結(jié)構(gòu)相吻合。
　　吸附動(dòng)力學(xué)模型分別以準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附模型、準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附模型和Elovich動(dòng)力學(xué)吸附模型考察CAPOP的吸附行為。研

15、究發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附模型可以解釋該吸附行為,證實(shí)CAPOP表面展示的七肽配基的活性位點(diǎn)越多,吸附能力就越強(qiáng),一旦七肽配基的活性位點(diǎn)覆蓋率變大,可供共價(jià)結(jié)合的位點(diǎn)減少,吸附能力下降。吸附熱力學(xué)研究表明:溫度在25℃以下,焓變值ΔH0為7.97kJ/mol說(shuō)明吸附反應(yīng)為吸熱反應(yīng),溫度地升高有利于吸附行為地發(fā)生,作用力包括化學(xué)作用和物理作用。ΔS0為0.044kJ/(mol K)表明吸附過(guò)程是一個(gè)七肽配基表面先脫附水分子,再吸附蛋白分子的循

16、環(huán)過(guò)程,即“溶劑置換作用”,同時(shí)證實(shí)整個(gè)體系的吸附過(guò)程是混亂度增加的吸熱過(guò)程。吉布斯自由能ΔG0為-5.14kJ/mol(298K)不僅證明了吸附行為是自發(fā)的,還證實(shí)物理作用與化學(xué)作用同樣存在于該吸附行為中,并發(fā)揮主要作用。在25℃以上,焓變值ΔH0為-12.02kJ/mol,熵變值ΔS0為-0.023kJ/(mol K),熵減焓減,說(shuō)明吸附體系存在“轉(zhuǎn)變溫度”,這可能是由于吸附過(guò)程產(chǎn)生了新的化學(xué)鍵。但吉布斯自由能ΔG0為-5.17kJ

17、/mol (298K),仍證明吸附行為是自發(fā)的,說(shuō)明吸附過(guò)程存在物理作用與化學(xué)作用,并隨溫度的升高產(chǎn)生了新的化學(xué)鍵。
　　采用Maestro9.0軟件對(duì)七肽配基和木瓜蛋白酶進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn),結(jié)果證實(shí)吸附行為不僅包含物理吸附(疏水作用),還包括化學(xué)偶聯(lián)作用(氫鍵作用)。CAPOP初步應(yīng)用于木瓜蛋白酶的分離純化。通過(guò)親和吸附四個(gè)步驟,收集酶活最高的組分,冷凍干燥后經(jīng)比酶活的計(jì)算和SDS-PAGE表征,得到純化倍數(shù)為粗酶溶液的

18、240.94倍,是染料親和膜的近10倍。證實(shí)所制備的CAPOP不僅能有效的分離純化木瓜蛋白酶,并表現(xiàn)為更高的分離效率,具備滿足醫(yī)療、生物生化工程、抗體工程等領(lǐng)域?qū)Ω呒兌饶竟系鞍酌感枨蟮臐摿?。以木瓜蛋白酶為模型蛋?研究七肽配基對(duì)木瓜蛋白酶的抑制行為和抑制機(jī)理。通過(guò)考察不同濃度的七肽分子對(duì)木瓜蛋白酶催化活性的抑制效果,采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,最終確定當(dāng)催化體系中七肽分子的濃度達(dá)到20mM時(shí),相對(duì)抑制率達(dá)到了66.41

19、％,得出導(dǎo)致木瓜蛋白酶酶活喪失50%時(shí)的七肽分子濃度(IC50)為14.2mM;當(dāng)七肽分子濃度為20mM時(shí),催化體系的延滯時(shí)間為421s,延長(zhǎng)了155%。同時(shí)證明七肽分子對(duì)木瓜蛋白酶酶活的抑制作用是屬于可逆性抑制。
　　綜上所述,本論文分別通過(guò)化學(xué)法和生物法制備兩種新型的親和色譜介質(zhì),設(shè)計(jì)思路具有典型性和拓展性,可推廣到任一目標(biāo)分離物(主要是蛋白質(zhì))的特異性配基篩選和規(guī)模性純化,這為新型生物多肽配基的開(kāi)發(fā)、親和色譜分離過(guò)程研究、分