以木瓜蛋白酶為模型蛋白的親和色譜新介質的制備及其吸附機理研究.pdf

1、親和色譜是一種利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力,選擇性地分離目標分離物的現(xiàn)代分離純化技術。隨著這些年高效親和色譜技術的發(fā)展與成熟,使其在有機化學、生物化學、分子生物學、生物工程、基因工程等領域的應用受到越來越廣泛的關注。然而由于親和配基價格昂貴、色譜操作壓大、處理量小等缺點,使之很難在低成本,高效率的前提下發(fā)揮更大的作用,因此尋找具有親和配基相似活性的小分子和發(fā)展新型廉價的載體材料成為亟待解決的問題。
　　目前,通過

2、組合篩選技術篩選親和配基和改良現(xiàn)有的色譜載體的方法占有主導地位,但是組合篩選技術很大程度上增加了篩選配基的工作量和成本,改良現(xiàn)有載體更是無法從根本上解決操作繁瑣,處理量小等缺陷。通過選擇價格低廉的染料或金屬離子為親和配基制備新型色譜介質,以及用生物技術淘洗親和配基的方法可以很好地解決上述兩個難題,而且可以在保證不降低目標分離物生物活性的前提下,快速、高效地進行分離純化操作。在此方面的研究中,選擇染料親和色譜和仿生配基親和色譜,發(fā)展新型載

3、體等課題引起了廣大研究學者的關注。
　　本文以木瓜蛋白酶為模型蛋白,分別通過化學法和生物法制備了兩種能夠低成本,高效率地分離純化模型蛋白的親和色譜新介質,即通過化學法制備了利用膜色譜的低壓降,染料配基的低成本的染料親和膜色譜介質;通過生物法制備了利用噬菌體展示技術的高效率,噬菌體交聯(lián)法的低損耗的交聯(lián)噬菌體七肽親和吸附介質(CAPOP)。分別考察了這兩種親和色譜介質對模型蛋白的吸附性能,利用親和吸附模型闡述了兩種親和色譜介質對模型蛋

4、白的吸附機理,并最終評價了對模型蛋白分離純化的有效性。
　　本文首先以機械強度好的尼龍膜為載體,利用化學法選擇1M HCl酸水解法、甲醛活化法、殼聚糖改性法,鍵合染料后制備出染料Reactive Red120親和膜色譜介質。通過掃描電鏡、紫外光譜、紅外光譜和元素分析對染料親和膜進行定性定量分析,確定染料親和膜殼聚糖含量為118.5+7.5mg/g,染料含量為163.4+10.3μmol/g,孔徑大小均勻(0.5-3.0μm),比表

5、面積大,利于蛋白質分子自由通過,是一種較為理想的分離純化介質。以木瓜蛋白酶為模型蛋白,采用靜態(tài)吸附法和動態(tài)脫附法研究染料親和膜色譜介質的蛋白質吸附性能。
　　靜態(tài)吸附法考察了配基供給量、緩沖液pH值、緩沖液鈉離子強度、吸附溫度和吸附時間等對木瓜蛋白酶吸附量的影響。在吸附條件為:染料配基濃度10.0mg/mL、緩沖液pH8.5、鈉離子強度為0M、吸附溫度為37℃、吸附3h時最大靜態(tài)吸附量達到37.0mg/g。動態(tài)脫附法考察了洗脫液、

6、洗脫液pH、洗脫液鈉離子強度和洗脫速度等對木瓜蛋白酶脫附量的影響。在動態(tài)脫附條件為NaCl洗脫液pH6.0,鈉離子強度為1.0M,洗脫速度為1mL/min地洗脫下,達到最大的動態(tài)脫附效果,純化后的酶活力達到1035.53U/mg,純化倍數約為20倍。
　　采用吸附等溫模型、吸附動力學模型、吸附熱力學模型和計算機模擬實驗闡述染料親和膜對模型蛋白木瓜蛋白酶的吸附機理。以Langmuir吸附模型和Freundlich吸附模型考察染料親和

7、膜的蛋白質吸附行為。研究發(fā)現(xiàn)Freundlich吸附模型可以較好地解釋染料親和膜的吸附行為,證實親和膜對木瓜蛋白酶的吸附是不均勻立體結構的多分子層吸附模型。吸附動力學模型分別用準一級動力學吸附模型、準二級動力學吸附模型、粒子內擴散吸附模型以及Elovich動力學吸附模型考察染料親和膜的吸附行為。
　　研究發(fā)現(xiàn)準二級動力學吸附模型可以較好解釋該吸附行為,證實染料親和膜表面染料配基的活性位點越多,吸附能力就越強,一旦染料配基的活性位點

8、覆蓋率變大,可供共價結合的位點減少,吸附能力下降。吸附熱力學研究結果為:焓變值ΔH0、熵變值ΔS0、吉布斯自由能ΔG0分別為18.52kJ/mol,0.077kJ/(mol K)和-4.43kJ/mol(298K)o焓變值ΔH0為18.52kJ/mol表明該吸附過程為吸熱反應,溫度的增加有利于吸附行為的發(fā)生,吸附作用力包括化學作用和物理作用。熵變值ΔS0為0.077kJ/(mol K)表明吸附過程是一個染料配基表面先脫附水分子,再吸附蛋

9、白分子的循環(huán)過程,即“溶劑置換作用”,同時證實整個體系的吸附過程是混亂度增加的吸熱過程。吉布斯自由能AG為-4.43kJ/mol(298K)不僅證明了吸附行為是自發(fā)的,還證實物理作用與化學作用同樣存在于該吸附行為中,并發(fā)揮主要作用。采用Maestro9.0軟件對染料配基和木瓜蛋白酶進行分子對接計算機模擬實驗,結果證實吸附行為不僅包含物理吸附(疏水作用),還包括化學偶聯(lián)作用(氫鍵)。
　　染料Reactive Red120親和膜初步

10、應用于木瓜蛋白酶的分離純化。通過上樣,分離,洗滌,洗脫四個步驟,收集酶活最高的一組組分,冷凍干燥后經比酶活計算和FPLC表征,得到純化倍數為粗酶溶液22.60倍的木瓜蛋白酶粉,證實所制備的染料Reactive Red120親和膜能有效的用于木瓜蛋白酶的富集和分離,能滿足皮革、飼料等領域對中等純度的木瓜蛋白酶需求。
　　論文同時以木瓜蛋白酶為模型,通過噬菌體展示技術篩選的七肽(Ile-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe)

11、為配基,以戊二醛為交聯(lián)劑,以交聯(lián)噬菌體為載體,利用生物法制備出交聯(lián)噬菌體七肽親和吸附介質(CAPOP)。通過透射電鏡、動態(tài)光散射儀、酶聯(lián)免疫吸附檢測對CAPOP進行定性分析,確定七肽配基的ELISAO0492值為1.9,證實對木瓜蛋白酶具有親和作用,交聯(lián)噬菌體團聚物的粒徑為5-6μm,是單個噬菌體粒徑的10倍左右,證實交聯(lián)成功。該介質具備特異性吸附高,價格低廉,制備簡易的優(yōu)點。采用靜態(tài)吸附法、響應面優(yōu)化法和動態(tài)脫附法研究CAPOP的蛋白

12、吸附性能。靜態(tài)吸附法主要考察了緩沖液pH值、緩沖液鈉離子強度、吸附溫度和吸附時間等對木瓜蛋白酶吸附量的影響。在吸附條件為緩沖液pH7.0,鈉離子強度為0M,吸附溫度為25℃,吸附2h時最大靜態(tài)吸附量達到50mg/g。采用響應面法分析了吸附過程中多種因素共作用對木瓜蛋白酶吸附量的關系。研究發(fā)現(xiàn)不同因素的共作用對吸附量有顯著影響,得到回歸方程并建立優(yōu)化條件:噬菌體展示配基含量為1011PFU/mL,pH值為6.9,溫度為32℃,木瓜蛋白酶粗

13、酶溶液濃度為7.51mg/mL,木瓜蛋白酶的吸附量最高,為55.4229mg/g。動態(tài)脫附法考察了洗脫液,洗脫液pH、洗脫液鈉離子強度和洗脫速度對木瓜蛋白酶吸附量的影響。在動態(tài)脫附條件為pH9.0,鈉離子強度為1.0M,洗脫速度為1.0mL/min的NaSCN溶液的洗脫下,達到最大的動態(tài)脫附效果,純化倍數達200倍左右,純化后的酶活力達到4647.73U/mg,基本與商品酶酶活持平。采用吸附等溫線模型,吸附動力學模型,吸附熱力學模型和計

14、算機模擬技術探討交聯(lián)噬菌體對木瓜蛋白酶的吸附機理。分別以Langmuir吸附模型和Freundlich吸附模型考察CAPOP的吸附行為。研究發(fā)現(xiàn)Freundlich吸附模型可以較好地解釋CAPOP的吸附行為,證實CAPOP對木瓜蛋白酶的吸附是不均勻立體結構的多分子層吸附模型,這與交聯(lián)噬菌體的立體結構相吻合。
　　吸附動力學模型分別以準一級動力學吸附模型、準二級動力學吸附模型和Elovich動力學吸附模型考察CAPOP的吸附行為。研

15、究發(fā)現(xiàn)準二級動力學吸附模型可以解釋該吸附行為,證實CAPOP表面展示的七肽配基的活性位點越多,吸附能力就越強,一旦七肽配基的活性位點覆蓋率變大,可供共價結合的位點減少,吸附能力下降。吸附熱力學研究表明:溫度在25℃以下,焓變值ΔH0為7.97kJ/mol說明吸附反應為吸熱反應,溫度地升高有利于吸附行為地發(fā)生,作用力包括化學作用和物理作用。ΔS0為0.044kJ/(mol K)表明吸附過程是一個七肽配基表面先脫附水分子,再吸附蛋白分子的循

16、環(huán)過程,即“溶劑置換作用”,同時證實整個體系的吸附過程是混亂度增加的吸熱過程。吉布斯自由能ΔG0為-5.14kJ/mol(298K)不僅證明了吸附行為是自發(fā)的,還證實物理作用與化學作用同樣存在于該吸附行為中,并發(fā)揮主要作用。在25℃以上,焓變值ΔH0為-12.02kJ/mol,熵變值ΔS0為-0.023kJ/(mol K),熵減焓減,說明吸附體系存在“轉變溫度”,這可能是由于吸附過程產生了新的化學鍵。但吉布斯自由能ΔG0為-5.17kJ

17、/mol (298K),仍證明吸附行為是自發(fā)的,說明吸附過程存在物理作用與化學作用,并隨溫度的升高產生了新的化學鍵。
　　采用Maestro9.0軟件對七肽配基和木瓜蛋白酶進行分子對接計算機模擬實驗,結果證實吸附行為不僅包含物理吸附(疏水作用),還包括化學偶聯(lián)作用(氫鍵作用)。CAPOP初步應用于木瓜蛋白酶的分離純化。通過親和吸附四個步驟,收集酶活最高的組分,冷凍干燥后經比酶活的計算和SDS-PAGE表征,得到純化倍數為粗酶溶液的

18、240.94倍,是染料親和膜的近10倍。證實所制備的CAPOP不僅能有效的分離純化木瓜蛋白酶,并表現(xiàn)為更高的分離效率,具備滿足醫(yī)療、生物生化工程、抗體工程等領域對高純度木瓜蛋白酶需求的潛力。以木瓜蛋白酶為模型蛋白,研究七肽配基對木瓜蛋白酶的抑制行為和抑制機理。通過考察不同濃度的七肽分子對木瓜蛋白酶催化活性的抑制效果,采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖,最終確定當催化體系中七肽分子的濃度達到20mM時,相對抑制率達到了66.41

19、％,得出導致木瓜蛋白酶酶活喪失50%時的七肽分子濃度(IC50)為14.2mM;當七肽分子濃度為20mM時,催化體系的延滯時間為421s,延長了155%。同時證明七肽分子對木瓜蛋白酶酶活的抑制作用是屬于可逆性抑制。
　　綜上所述,本論文分別通過化學法和生物法制備兩種新型的親和色譜介質,設計思路具有典型性和拓展性,可推廣到任一目標分離物(主要是蛋白質)的特異性配基篩選和規(guī)模性純化,這為新型生物多肽配基的開發(fā)、親和色譜分離過程研究、分