木瓜蛋白酶具有水解殼聚糖活性的酶組分分離純化研究.pdf

1、木瓜蛋白酶能非專一性地水解殼聚糖，但其水解殼聚糖的作用方式和水解機理等方面仍不清楚。本論文研究木瓜蛋白酶具有水解殼聚糖活性成分的分離和純化，對于進一步闡明非專一性酶水解殼聚糖的作用機理具有重要的學術意義，同時對于酶法生產甲殼低聚糖具有重要的應用價值。 首先對五種商品木瓜蛋白酶制劑降解殼聚糖的活性進行比較，從中篩選出一種降解殼聚糖活性較高的木瓜蛋白酶Ⅱ，作用于不同脫乙酰度殼聚糖的結果表明，此酶的最佳底物是殼聚糖Ⅰ，脫乙酰度為85.

2、7％。木瓜蛋白酶Ⅱ降解殼聚糖的最適條件是底物濃度0.5％、pH4.0、40℃、酶底物比10％。在最適條件下木瓜蛋白酶Ⅱ降解殼聚糖時，30min 內導致粘度下降百分比達到70.77％，1h之后粘度變化平緩。采用Sepharose CL-6B 凝膠柱測定木瓜蛋白酶Ⅱ降解殼聚糖6h 和加滅活酶反應產物相對分子質量分布，結果顯示木瓜蛋白酶Ⅱ降解殼聚糖產物的相對分子質量主要集中在11943 到2899；加滅活酶反應產物的相對分子質量主要集中在35

3、490 到10162。 采用截留相對分子質量為10000 的中空纖維膜對木瓜蛋白酶Ⅱ進行超濾濃縮分離，室溫下最佳操作壓力為0.1MPa，超濾濃縮倍數(shù)為8 倍時，可以得到最高具有殼聚糖酶活性的組分。超濾后木瓜蛋白酶Ⅱ的蛋白酶和殼聚糖酶比活力分別從435.10U/mg 和2.17U/mg 提高到531.39U/mg 和2.65U/mg，純化倍數(shù)均提高了1.22 倍。SDS-PAGE 圖譜顯示，超濾去除了相對分子質量小于10000 的

4、雜蛋白，其純度得以提高。成分分析表明，超濾后的木瓜蛋白酶制劑中還原糖含量由57.46％降至6.27％。 采用制備型聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化超濾后的木瓜蛋白酶Ⅱ，膠濃度為10％的分離膠、4％的濃縮膠。制備電泳圖譜上顯示有五條明顯的酶條帶，酶活性測定顯示條帶2 具有較高的殼聚糖酶活性，對該條帶進行富集獲得具有殼聚糖酶活性的單一酶組分。采用SDS-PAGE 和HPLC 對此純化酶組分進行純度鑒定，結果顯示為單一條帶和單一峰，說明木瓜

5、蛋白酶Ⅱ中存在具有水解殼聚糖的酶組分。LC-MS/MS 測定該純化酶組分的氨基酸序列為MRITISGSPGSGTTTLGRSI AEKYSYRYVS AGEVFRGLAK ERNMDLAAFG KIAETDPAIDLEIADARQKEI GESSDDIILE GRLAGWMVEN ADLKILLCAS PECRSTRIAAREGLTEKQAF EMTIEREACE AGRYMEYYEI DILDFSPYDL ILNSETFSANELFA