木瓜蛋白酶的化學修飾及固定化研究.pdf

1、酶的化學修飾能夠改進酶的物理化學性能、提高其生物活性，已受到越來越多的重視。其主要方法包括交聯(lián)技術(shù)，定點突變和化學修飾結(jié)合技術(shù)、小分子修飾、單功能聚合物化學修飾等。酶的固定化處理能夠進一步提高其穩(wěn)定性。
　　 木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)作為水解蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶家族，主要存在于番木瓜的乳汁中，其應用廣泛，包括細胞分離、化妝品、洗滌劑、食品和醫(yī)藥等行業(yè)，由于受到環(huán)境和其他條件的影響，容易變性失活，降低催化效率，從而限

2、制了其大規(guī)模的應用。
　　 本論文首次以三種新型的酸酐修飾劑在底物保護和無底物保護下對木瓜蛋白酶進行化學修飾，以三硝基苯磺酸法測定修飾酶的平均氨基修飾率，對修飾前后的木瓜蛋白酶分別純化并通過UV-vis和IR對其結(jié)構(gòu)進行了表征?？疾炝藴囟?、pH值、表面活性劑SDS和金屬離子對化學修飾酶活力的影響，并與天然木瓜蛋白酶進行了比較，對天然酶和修飾酶進行了動力學和熱力學研究。結(jié)果表明，化學修飾酶的最適反應溫度為80℃;最適pH值為9.0

3、;在SDS濃度為5mg/mL時修飾酶酶活仍能保持在50％左右；在所有酶中，均苯四甲酸酐修飾酶的催化效率最高，為2.442×102，△H*，△G*和△S*分別為131.8kJ/mol，80.17kJ/mol和151.9J/mol·K，顯示了化學修飾提高了木瓜蛋白酶的穩(wěn)定性。與天然酶相比，化學修飾酶的熱穩(wěn)定性、耐堿性和耐洗滌性得到了明顯提高。
　　 本論文通過合成方法制備了兩種不同分子量的單甲氧基聚乙二醇(mPEG)衍生物，對木瓜蛋

4、白酶進行了修飾，對修飾酶的熱穩(wěn)定性、耐酸堿性、在有機溶劑中的穩(wěn)定性和動力學等相關(guān)參數(shù)進行了測定并對其結(jié)構(gòu)進行了一系列表征。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶經(jīng)過不同分子量的修飾劑修飾后，其活性均得到了很好的保留；熱穩(wěn)定性測定顯著提高，且熱穩(wěn)定性與修飾劑分子量有關(guān)；修飾酶Km值的測定表明在活潑位點不被修飾、整體結(jié)構(gòu)不發(fā)生較大改變的情況下可以保持較高的對底物的表觀親和力。隨著修飾劑分子量的增大，修飾酶的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳速度減慢。
　　 另

5、外，本論文將化學修飾酶進行了固定化處理，先對棉布進行活化，以活化后的棉布為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，對修飾前后的木瓜蛋白酶分別進行固定化，考察了固定化酶性質(zhì)，對固定化酶棉織物的貯存穩(wěn)定性、回潮率和透氣性能進行了測定，并首次探討了木瓜蛋白酶對酪氨酸的抑制作用。結(jié)果表明，棉布經(jīng)過活化以后，在溫和條件下實現(xiàn)木瓜蛋白酶固定化，固定化酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性有了明顯的提高。在不加任何保護劑的條件下，在室溫條件下放置30d后游離酶僅保持一半的酶活，固定