菠蘿蛋白酶的提取純化及化學(xué)修飾對(duì)其活性的影響

1、菠蘿蛋白酶的提取純化及化學(xué)修飾對(duì)其活性的影響菠蘿蛋白酶的提取純化及化學(xué)修飾對(duì)其活性的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握從原料物中提取活化分離菠蘿蛋白酶的方法。2、學(xué)習(xí)酶活力測(cè)定的方法。3、了解某些因素對(duì)菠蘿中菠蘿蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響。4、掌握用聚乙二醇對(duì)菠蘿蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾的原理。5、比較修飾酶與未修飾酶的活力。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理菠蘿蛋白酶(Bromelain，簡(jiǎn)稱菠蘿酶，亦稱為鳳梨酶或鳳梨酵素)是從菠蘿果莖、葉、皮提取出來，

2、經(jīng)精制、提純、濃縮、酶固定化、冷凍干燥而得到的一種純天然植物蛋白酶。分子量為33000等電點(diǎn)為9.55，白色至淺棕黃色無定形粉末，溶于水。水溶液無色至淡黃色，有時(shí)有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。屬糖蛋白，能分解蛋白質(zhì)、脂類和酰胺等。品質(zhì)最佳的菠蘿蛋白酶是利用菠蘿的中莖加工采用超濾方法進(jìn)行過濾濃縮低溫冷凍干燥而得的。它作為一種食品添加劑可用于肉質(zhì)嫩化、啤酒澄清.還用于明膠、水解蛋白的生產(chǎn)在醫(yī)藥上它可在生物體內(nèi)溶解纖維蛋白及血凝塊。因此可

3、以治療水腫及多種炎癥它能迅速溶痂。對(duì)正常組織無害不影響植皮適用于中小面積深度燒傷的治療。1、本實(shí)驗(yàn)先從新鮮的菠蘿汁中使用單寧沉淀法提取出菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶將酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸，通過測(cè)定吸光度的變化，可以測(cè)得菠蘿蛋白酶的活力。2、本實(shí)驗(yàn)采用離子交換技術(shù)純化菠蘿蛋白酶。與化學(xué)方法相比，它分離條件溫和，不引起分子結(jié)構(gòu)的變化。它用于純化菠蘿蛋白酶的關(guān)鍵問題是選擇合適的交換樹脂及相應(yīng)的交換條件。3、菠蘿蛋白酶活性單位的定義：一個(gè)酶活力單位（

4、U）定義為特定條件下[pH7.0，(371℃)]酶作用于干酪素底物1min產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量。菠蘿蛋白酶將酪蛋白分解，生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在275nm處有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光度計(jì)(275nm)測(cè)定溶液中所含肽的數(shù)量。菠蘿蛋白酶酶活計(jì)算公式參照何鐵劍的方法[91]。每毫升酶液活性單位（Uml）=AA0AwM標(biāo)Vt樣品稀釋倍數(shù)供測(cè)體積式中：(AA0)為275nm波長(zhǎng)下待測(cè)酶液與對(duì)照的光密度差值；Aw

5、指以水為對(duì)照，275nm波長(zhǎng)下50μgmL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸光密度值；M標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液濃度；V為反應(yīng)體系總體積（mL）；t為反應(yīng)時(shí)間10min。4、修飾的菠蘿蛋白酶對(duì)溫度和pH值的穩(wěn)定性均比天然酶有很大程度的提高。菠蘿蛋白酶是一種巰基蛋白酶但它的穩(wěn)定性較差影響了它的應(yīng)用。此外菠蘿蛋白酶易受有關(guān)因素的影響而失活。聚乙二醇(PEG)為一種無毒且具親水性的免疫惰性大分子，本實(shí)驗(yàn)采用聚乙二醇對(duì)菠蘿蛋白酶進(jìn)行修飾提高了其對(duì)環(huán)境的穩(wěn)定性使其半衰期延長(zhǎng)。

6、三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料（一）試劑和材料（一）試劑和材料1、新鮮菠蘿(0.735kg)2、0.1mgml牛血清蛋白檸檬酸鈉、單寧、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化鈉溶液、1%酪蛋白溶液、1molL氫氧化鈉溶液、0.05molL磷酸緩沖液、激活劑、考馬斯亮藍(lán)、Brolain試劑、0.1molL檸檬酸鹽緩沖液、PEG活性酯、50%乙二醇、50%甘露醇、50%葡萄糖溶液、50%甘油溶液（二）實(shí)驗(yàn)儀器（二）實(shí)驗(yàn)儀器榨汁機(jī)；離心機(jī)；紫外可見分光

7、光度計(jì)（1cm石英比色皿）；恒溫水浴鍋（37℃）；試管、試管架；燒杯、容量瓶；移液管；離子交換柱(25010mm)；蠕動(dòng)泵；自動(dòng)部分收集器菠蘿蛋白酶酶活力測(cè)定采用連續(xù)測(cè)定法，以酪蛋白為底物，經(jīng)菠蘿蛋白酶水解后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，每五分鐘測(cè)定一次，大致表示為酶活性。3.1、不同溫度下的酶活性變化：溫度（℃）152540506070吸光度值3.2、不同PH值下得酶活性PH值3.04.05.06.07.08.09.0吸光度值3.3、在

8、以上實(shí)驗(yàn)的相同條件下，在測(cè)定所用的酶試劑中分別加入12滴50%甘油溶液，然后與之前相同進(jìn)行測(cè)定酶活性變化情況。50%乙二醇、50%甘露醇、50%葡萄糖溶液之后與50%甘油溶液相同處理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。試劑50%甘油溶液50%乙二醇溶液50%甘露醇溶液50%葡萄糖溶液吸光度值（四）（四）NEM修飾及修飾與未修飾酶的活性比較：修飾及修飾與未修飾酶的活性比較：4.1修飾酶的制備60gNEM溶于40ml干燥吡啶，加入1.01g琥珀酸酐，60度保溫2h，

9、在60度減壓蒸餾除去溶劑。加入苯至殘余物溶解，再加100ml冷己烷，4度振蕩2h。過濾，殘?jiān)苡谡麴s水后透析，凍干。將其與菠蘿蛋白酶按配比投料，加入0.1molL檸檬酸緩沖液（PH3.0），4度反應(yīng)4h。產(chǎn)物在PH4.6檸檬酸緩沖液中透析，凍干后得NEM菠蘿蛋白酶（修飾酶）。4.2修飾與未修飾酶的活性比較（1）分別取修飾酶與未修飾酶，溶解于0.05molL磷酸緩沖液中（PH7.0）至10ml，離心得上清液（2）取15支試管，分為三組，每