菠蘿蛋白酶的分離純化及部分應(yīng)用性質(zhì)的研究.pdf

1、為滿足醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)Ω呋钚愿呒兌炔ぬ}蛋白酶的大力需求，更進一步了解菠蘿蛋白酶應(yīng)用的有關(guān)性質(zhì)，本試驗以菠蘿下腳料菠蘿皮為試驗原料，對菠蘿蛋白酶的分離純化、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、活性的應(yīng)用等方面進行了初步研究，主要內(nèi)容如下：
　　 (1)利用硫酸銨分級沉淀結(jié)合CM Sepharose FF陽離子交換柱層析的方法對皮汁中所含的菠蘿蛋白酶進行分離提純，以獲得試驗所需材料。對提取的菠蘿蛋白酶進行研究結(jié)果表明，運用此法分離純化效果比較理想，洗脫峰上出現(xiàn)一

2、個主峰，酶活性峰位于峰肩部位，純化過程中該離子交換柱層析純化效果較為顯著，能去除色素，使純度提高35.1倍，經(jīng)純化后菠蘿蛋白酶的比活達9400U/mg，活力回收率為48.7[％]。
　　 (2)對菠蘿蛋白酶的部分性質(zhì)進行研究結(jié)果表明，皮汁中菠蘿蛋白酶相對分子質(zhì)量為28800Da，純酶液在280nm處有明顯的特征吸收峰。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果顯示單一條帶，表明其純度已達到電泳純。通過測定溫度對菠蘿蛋白酶酶活的影響可知

3、，菠蘿蛋白酶的最適溫度為55～65℃，在60℃時活性最高。此酶在pH 7.5近中性環(huán)境中，酶活性最高。處于偏酸性(pH<7.0)環(huán)境中，酶反應(yīng)速度下降快；在偏堿性(pH>7.5)的環(huán)境中，菠蘿蛋白酶活性逐漸下降。通過測定金屬離子對酶活的影響可知，二價鐵離子對菠蘿蛋白酶有明顯的激活作用，鋅離子和銅離子的作用次之，在濃度較低時對菠蘿蛋白酶表現(xiàn)一定的激活作用，分別比對照提高了31.9[％]、18.2[％]，但當濃度較大時反而起抑制作用。增加N

4、aCl對菠蘿蛋白酶也能起到一定的保護作用、KCl對酶反應(yīng)影響不大，而MgSO4·7H2O和無水CaCl2對菠蘿蛋白酶活性均有一定程度的抑制作用。在模擬豬胃條件下pH2.5胃蛋白酶對菠蘿蛋白酶影響較大，37℃保溫處理2h、3h后，菠蘿蛋白酶的活性損失分別為49.2[％]、61.9[％]。經(jīng)IR圖譜分析顯示此酶具有蛋白質(zhì)的特征吸收峰，但結(jié)構(gòu)基團與Sigma公司的莖酶標準品比較稍有不同。
　　 (3)在K88陽性產(chǎn)腸毒素大腸桿菌對小腸

5、上皮細胞的黏附試驗中，感染組1的黏附率最低，作用效果最好。空白對照組中大腸桿菌對小腸上皮細胞的黏附率在相互作用的前三個小時內(nèi)平均達90.6[％]，經(jīng)菠蘿蛋白酶處理的小腸上皮細胞再加K88+ETEC大腸桿菌感染時，在培養(yǎng)的前兩個小時未見有黏附，在第3h待菠蘿蛋白酶的活性有所降低時，有1.85[％]的黏附率。在感染組2中，大腸桿菌細胞壁經(jīng)菠蘿蛋白酶水解作用后，其黏附小腸上皮細胞的能力在1h、2h、3h內(nèi)較空白對照分別降低31.79[％]、5