聚乙二醇修飾對(duì)去折疊胰蛋白酶的影響.pdf

1、天然胰蛋白酶(NT)容易受外界因素的影響,熱穩(wěn)定性不好,自溶嚴(yán)重。前期研究表明動(dòng)態(tài)高壓微射流(DHPM)誘導(dǎo)的去折疊胰蛋白酶(DT)熱穩(wěn)定性提高,但去折疊胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)處于熱力學(xué)上的不穩(wěn)定狀態(tài),容易集聚或再折疊而影響其酶學(xué)性能。本課題旨在研究琥珀酰亞胺碳酸酯和琥珀酰亞胺琥珀酸酯活化的單甲氧基聚乙二醇(mPEG-SC和mPEG-SS)修飾對(duì)天然胰蛋白酶和去折疊胰蛋白酶活性、熱穩(wěn)定性、自溶、動(dòng)力學(xué)參數(shù)和構(gòu)象變化的影響,對(duì)比分析了天然胰蛋白酶

2、和去折疊胰蛋白酶的修飾效果。
　　 不同分子量的mPEG-SC(1000、2000、5000、10000、20000Da)修飾對(duì)天然胰蛋白酶的活性影響不大,但是酶熱穩(wěn)定性提高,酶自溶降低,其中mPEG-SC(5000Da)修飾的天然胰蛋白酶熱穩(wěn)定性最高,自溶最低。在50℃下,mPEG-SC(5000Da)修飾后天然胰蛋白酶的相對(duì)活性由未修飾的32.1％提高到79.4%;在40℃下保溫120min后,mPEG-SC(5000Da)

3、修飾后天然胰蛋白酶的相對(duì)活性由未修飾的42.3%提高到73.9%。構(gòu)象變化分析表明,紫外吸光值和熒光強(qiáng)度都下降了,并伴有輕微的藍(lán)移,圓二色譜中負(fù)橢圓度升高,說明mPEG-SC修飾影響了天然胰蛋白酶的構(gòu)象,發(fā)色基團(tuán)部分被掩埋,疏水環(huán)境部分被屏蔽,酶分子的微環(huán)境發(fā)生了變化,二級(jí)結(jié)構(gòu)的β-折疊含量上升,無規(guī)則卷曲含量下降。5000Da的mPEG-SC修飾后天胰蛋白酶的構(gòu)象變化最明顯,如修飾后天然胰蛋白酶的β-折疊含量由51.2%提高到56.7

4、%。
　　 通過mPEG-SC(5000Da)修飾DHPM誘導(dǎo)的去折疊胰蛋白酶,結(jié)果表明mPEG-SC修飾對(duì)去折疊胰蛋白酶的活性影響不大,但去折疊胰蛋白酶熱穩(wěn)定性得到了極大的提高,酶自溶極大降低了。同時(shí),修飾的去折疊胰蛋白酶與底物的親和度及催化效能明顯提高。修飾后去折疊胰蛋白酶的Km值從0.35mM下降到0.15mM,Kcat/Km值從11.83s-1mM-1上升到20.13s-1mM-1。構(gòu)象分析表明修飾后去折疊胰蛋白酶的紫外

5、吸光值和熒光強(qiáng)度都下降了,熒光吸收峰有明顯的藍(lán)移,說明酶分子中的發(fā)色基團(tuán)和疏水環(huán)境被部分掩埋,酶分子所處的微環(huán)境發(fā)生了改變。二級(jí)結(jié)構(gòu)的β-折疊含量上升,無規(guī)則卷曲含量下降,修飾后去折疊胰蛋白酶的β-折疊含量從49.7%提高到58.410/0。對(duì)比分析mPEG.SC修飾對(duì)天然胰蛋白酶和去折疊胰蛋白酶的影響,表明修飾的去折疊胰蛋白酶的酶學(xué)性能得到了更大程度的改善,而其空間構(gòu)象的變化也更大。另外,結(jié)果表明修飾酶的酶學(xué)性質(zhì)變化與構(gòu)象改變之間有一

6、定的關(guān)聯(lián)性。
　　 分析不同濃度的尿素對(duì)mPEG-SC(5000Da)修飾的去折疊胰蛋白酶構(gòu)象變化的影響,表明修飾后去折疊胰蛋白酶明顯提高了對(duì)尿素變性作用的抗性。隨著尿素濃度的升高,酶樣的構(gòu)象逐漸被破壞,天然胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)在尿素濃度為6mol/L時(shí)受到最大程度的破壞,去折疊胰蛋白酶在4mol/L時(shí)就遭受嚴(yán)重破壞,而修飾后去折疊胰蛋白酶在8mol/L時(shí)才遭受嚴(yán)重破壞。
　　 研究mPEG-SS(5000Da)修飾對(duì)天然胰蛋