聚乙二醇對超氧化物歧化酶修飾技術(shù)及產(chǎn)物研究.pdf

1、本文建立了一種簡單、快速、有效的超氧化物歧化酶分離方法，評價了兩種聚乙二醇(PEG)對純化SOD的修飾效果，優(yōu)化SS-PEG修飾SOD反應(yīng)條件，純化修飾酶并對其進行性質(zhì)研究，通過抗熱、抗酸堿、抗酶解實驗研究不同條件對PEG-SOD活性的影響，修飾SOD與修飾前相比，其穩(wěn)定性大大提高，為PEG-SOD的申報新藥及藥用研究開發(fā)提供技術(shù)支持和理論依據(jù)，對其它藥用蛋白的PEG化亦有很大的參考價值，也對蛋白質(zhì)藥物的開發(fā)應(yīng)用提供一種新途徑。具體研究

2、內(nèi)容如下： 一：SOD純化研究 建立了用Q XL陰離子交換層析柱純化牛Cu, Zn-SOD粗酶的方法。將SOD粗酶經(jīng)pH7.4的PB溶解，在Q XL柱上以PB+ NaCl為流動相進行梯度洗脫。在檢測波長280nm處獲得蛋白峰，SEC-HPLC圖譜中，透過液的出峰時間與SOD主峰一致，經(jīng)SDS-PAGE電泳和活力測定表明透過峰蛋白質(zhì)具有SOD相同分子量及較高酶活力，證實透過峰即為目的峰。收集透過峰，經(jīng)透析、冷凍干燥后所得S

3、OD的純度為85％。而酶活力由原來的1774.812NU/mg，提高到4294.76NU/mg，總的酶活損失較小，活性回收率達79.7％。 二：聚乙二醇修飾SOD反應(yīng)條件研究 選擇兩種PEG作為修飾劑，一種是PEG-醛(ALD-PEG)，另一種為PEG-琥珀酸琥珀酰亞胺酯(SS-PEG)。對SS-PEG修飾SOD的反應(yīng)條件進行了考察，評判標準是SDS-PAGE電泳圖中修飾產(chǎn)物均一性及酶剩余活性的大小。其中在SS-PEG與

4、SOD摩爾比為12:1，反應(yīng)溫度為4℃，pH為7.4，反應(yīng)時間半小時的條件下，獲得修飾產(chǎn)物剩余酶活較高為89.3％，修飾產(chǎn)物專一。 三：聚乙二醇修飾酶的分離純化、鑒定及其性質(zhì)研究 根據(jù)修飾產(chǎn)物之間分子量的差別，利用Sephadex G100凝膠過濾層析對反應(yīng)液進行分離純化，獲得了電泳純的PEG-SOD，并對其采用SDS-PAGE電泳進行鑒定，初步證實了分子量。 本文對PEG-SOD修飾酶在抗熱、抗酸堿、抗酶解能力

5、方面進行了研究，并測定了修飾酶的剩余酶活力及氨基修飾率。結(jié)果表明：PEG修飾SOD在抗熱能力方面與天然酶相比明顯增強，在80℃保溫 0.5h，修飾酶殘余活力為90％，而天然酶是63％；修飾酶與天然酶在抗酸堿能力方面也明顯不同，修飾酶抗酸能力強，在pH2.0時活力為78％，而天然酶為22％；修飾酶在抗胃蛋白酶解方面也有了較大提高。這些結(jié)果暗示，在不同環(huán)境下，修飾酶較天然酶能更好地保持酶活力。測得蛋白質(zhì)氨基修飾率為62.1％，應(yīng)用SOD分子