奈米非肽聚乙二醇修飾的初步研究.pdf

1、蛋白質(zhì)聚乙二醇化技術(shù)可以有效地降低藥物蛋白質(zhì)免疫原性，延長其循環(huán)半衰期并改善其藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)等性質(zhì)，因此成為近些年的研究熱點(diǎn)。PEG修飾技術(shù)對氨基修飾的作用位點(diǎn)主要發(fā)生在α-NH2和ε-NH2，本文采用5kDa的單甲氧基聚乙二醇(mPEG5000)為原料，自制樹脂-Nemifitide做為PEG修飾的偶聯(lián)載體，使mPEG選擇性地與肽末端α-NH2發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，減少了反應(yīng)副產(chǎn)物的量，簡化了分離純化的過程。
　　 本論文研究內(nèi)容

2、如下：
　　 1、以Rink Amide MBHA樹脂為反應(yīng)起點(diǎn)，針對微波反應(yīng)功率、溫度、升溫時(shí)間、維持時(shí)間四個(gè)主要影響氨基酸結(jié)合率的因素、采用正交實(shí)驗(yàn)對困難氨基酸Fmoc-Hyp-OH、Fmoc-(4-F)Phe-OH的微波反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件為：功率600W、溫度60℃、升溫時(shí)間2min、維持時(shí)間4min。采用微波輔助合成，合成反應(yīng)時(shí)間從近2h縮短至8min，對樹脂-Nemifitide的手工合成及微波輔助合成

3、進(jìn)行比較，粗肽得率從57.2％提高到80.4％。
　　 2、以mPEG5000為原料，利用N-羥基琥珀酰亞胺活化法、氯化亞砜活化法、二甲亞砜-醋酐(DMSO-Ac2O)活化法分別對mPEG端羥基活化進(jìn)行研究，制備了不同類型的mPEG修飾劑分別為mPEG-SS、mPEG-苯甲醛、mPEG-OCH3CHO。mPEG-SS在偶聯(lián)反應(yīng)的切割過程中，95％TFA導(dǎo)致酯鍵斷裂。mPEG-苯甲醛衍生物，與肽的偶聯(lián)過程中引入了苯甲醛結(jié)構(gòu)，生物安

4、全性低于mPEG-OCH3CHO。mPEG-OCH3CHO做為修飾劑與樹脂-肽偶聯(lián)，經(jīng)MALDI-TOF-MASS和SDS-PAGE結(jié)果證明，可以成功修飾Nemifitide。
　　 3、分別采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)考察了pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、mPEG-OCH3CHO投入量各因素對修飾反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響，建立了mPEG修飾小肽的的最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度為室溫，pH=6，反應(yīng)時(shí)間5h，mPEG-OCH3CHO投入量為樹脂-N

5、emifitide游離氨基的12倍。
　　 4、采用反相液相色譜(RP-HPLC)、分子篩色譜初步建立了mPEG-Nemifitide分離純化的方法。修飾產(chǎn)物混合體系中的組分可得到較好的分離效果。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果顯示mPEG-Nemifitide在4.1kDa～6.5kDa之間出現(xiàn)單條帶。飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MASS)檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)修飾產(chǎn)物的分子量呈正態(tài)分布，符合聚乙二醇分子量分布特性